人类p100蛋白对HeLa细胞周期的影响及其机制研究

论文摘要

目的：细胞周期是指连续分裂的细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个序贯过程,其正常运转需要一系列蛋白精确表达、共同调控。细胞周期的调节机制主要包括细胞周期素（cyclins）、细胞周期素依赖性激酶（CDKs）和细胞周期素依赖性激酶抑制剂（CKIs）,它们形成复杂的调节网络,当某一环节发生改变时将可能导致细胞增殖失控甚至癌症的发生。目前对细胞周期调控的研究主要集中在对关键调控蛋白的转录表达调控以及磷酸化／去磷酸化等方面的研究。p100蛋白是新被发现的一种多功能蛋白,它的结构是由4个重复的SN（葡萄球菌核酸酶,Staphylococcal Nuclease）片段和随后的Tudor-SN（TSN）片段构成。作为基因转录和pre-mRNA剪接加工的双重调控因子,p100蛋白的SN片段可促进STAT6介导的转录活性调控,从而在细胞因子介导的信号传导通路中发挥作用；同时其TSN片段可与snRNPs（小核核糖核蛋白）复合体相互作用,加速剪切体装配和pre-mRNA剪接加工过程。由于细胞周期是机体在细胞水平的基本生命活动,其核心内容为DNA的复制以及相关蛋白时序性的转录表达。而p100蛋白又是调节机体在分子水平的基本活动---基因转录的重要调节子,因此推测p100蛋白有可能调控细胞周期相关蛋白的转录表达,从而对细胞的生物学行为产生影响。本研究的主要目的是探讨p100蛋白对细胞周期的影响,并从细胞周期相关蛋白转录表达调控的角度探讨其分子机制。方法：本课题分为三部分进行。第一部分以p100蛋白过表达稳定株HeLa-pSG5-p100-flag为细胞模型,分别进行启动子芯片（ChIP-GLAS）检测和表达谱基因芯片检测,寻找p100蛋白可能作用的靶基因。第二部分为构建抑制p100蛋白表达的稳定细胞株。应用RNA干扰技术,构建能表达siRNA的重组表达质粒pGenesil-shRNA-hp 100,以脂质体法转染HeLa细胞,经G418筛选出稳定细胞株,Western blotting法检测瞬时转染及稳定株之p100蛋白表达抑制率。第三部分：为研究p100蛋白和细胞周期的关系,本部分又分为如下三组实验：实验一,p100蛋白与HeLa细胞周期分布的关系研究。使用胸腺嘧啶核苷双阻断法同步化五组细胞（HeLa, HeLa-pSG5, HeLa-pSG5-p100, HeLa-HK, HeLa-p100Ⅰ）,分别于释放后不同时间点收取细胞,PI染色,行流式细胞术检测细胞周期分布情况。实验二使用MTS法p100蛋白对HeLa细胞体外增殖能力的影响。实验三,探讨p100蛋白与细胞周期相关蛋白的关系。从启动子芯片以及基因表达谱芯片的结果中挑选出两个蛋白作为研究对象——Chk1及CDKN2C（p18）,分别采用Western blotting和Real-time PCR法,以β-actin和GAPDH为内参,观察比较在p100过表达和抑制表达的情况下,CDKN2C和Chk1的蛋白水平和mRNA水平有何差异。结果：第一部分,启动子芯片提示,p100蛋白可与几个细胞周期相关基因（如Chkl, CDKN2A, E2F1, RB等）的启动子具有较高的结合亲和力。第二部分研究中构建了能表达siRNA的重组表达质粒,转染HeLa细胞后,经G418筛选出抑制p100蛋白表达的稳定细胞株HeLa-p100Ⅰ, Western blotting鉴定瞬时转染和稳定株之p100蛋白表达抑制率分别为47.59%和62.86%。第三部分实验一结果表明,p100蛋白对HeLa细胞周期有影响：p100蛋白过表达或抑制表达时均使HeLa细胞周期G1期细胞比例增加,G2期和S期细胞比例减少。实验二结果显示,当p100蛋白过表达时促进HeLa细胞增殖；在瞬时抑制p100蛋白表达时则抑制细胞增殖。实验三结果显示：在HeLa细胞中,①p100蛋白下调CDKN2C（p18）蛋白表达：瞬时或稳定抑制p100蛋白表达均可显著提高CDKN2C（p18）的蛋白水平和mRNA水平。而p100蛋白过表达时CDKN2C （p18）的蛋白水平降低。②p100蛋白上调Chk1蛋白表达：当p100蛋白过表达时,Chk1蛋白水平升高；反之,亦然。结论：1.p100蛋白与HeLa细胞周期相关,鉴于p100蛋白过表达或抑制表达均使HeLa细胞G1期比例增加,故认为p100蛋白对细胞周期的调控机制很复杂,可能通过多途径既能抑制某些细胞周期相关蛋白表达,也能促进另外一些相关蛋白表达所造成。2.p100蛋白促进HeLa细胞增殖。3.p100蛋白下调CDKN2C的蛋白水平,而上调Chk1的蛋白水平。由此我们推测p100蛋白与细胞周期的关系很可能是通过调节几个细胞周期蛋白的作用而实现的。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、利用芯片技术寻找人类p100蛋白调控的靶基因
• 1.1 对象和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、人类p100蛋白表达抑制稳定株的构建
• 2.1 对象和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、人类p100蛋白与HeLa细胞周期的关系研究
• 实验一 人类p100蛋白与HeLa细胞周期分布的关系研究
• 实验二 人类p100蛋白对HeLa细胞体外增殖作用的研究
• 实验三 人类p100蛋白与细胞周期相关蛋白Chk1、CDKN2C的关系研究
• 结论
• 创新点
• 展望
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• INK4家族和细胞周期
• 综述参考文献
• 致谢