论文摘要
胃癌是消化系统病死率较高的恶性肿瘤之一,主要依赖手术及化疗等综合手段进行治疗,整体疗效尚不满意,对胃癌的早期诊断依然是提高患者生存率的关键。由于恶性肿瘤各种基因和蛋白等分子之间存在错综复杂的联系,对胃癌的发生发展以及浸润转移等机制尚无充分的认识,肿瘤标志物和基因治疗的研究依然是胃癌研究中的难点。我室在前期的研究中,发现S100A2与FAM3B基因在胃癌组织与癌旁正常组织之间的表达存在明显的差别。本课题旨在进一步深入了解这两个基因在胃癌发病中可能存在的作用,探讨这两个基因在细胞系中的生物学功能。目的:研究S100A2与FAM3B基因的细胞生物学功能,探讨其在胃癌发病中的意义。方法1、应用RT-PCR和Western blot以及细胞免疫化学技术,从mRNA和蛋白水平检测胃正常上皮细胞系GES-1与胃癌细胞系SGC7901、BGC823和MGC803等细胞系中S100A2与FAM3B的表达情况。2、应用RT-PCR技术,从胃癌癌旁正常组织中扩增S100A2与FAM3B全长基因,构建真核表达载体。将重组质粒转染胃癌细胞BGC823,激光共聚焦显微镜观察S100A2、FAM3B与EGFP融合蛋白在胃癌细胞内的亚细胞分布。3、经转染S100A2和FAM3B重组质粒的BGC823细胞,用G418筛选获取稳定转染细胞株。通过HE染色、MTT、穿膜实验以及细胞周期和Cleaved PARP的检测,分析转染目的基因细胞株与空载体细胞株在细胞形态、增殖速度、运动能力、对细胞周期的影响以及细胞凋亡等方面是否存在差异,从而推测目的基因的细胞生物学功能。结果1、S100A2 mRNA和蛋白在胃癌细胞系中表达降低;而FAM3B mRNA和Western blot虽然在4株细胞系无明显差异,但细胞免疫化学显示:GES-1细胞中表达较多,BGC823表达中等,SGC7901细胞表达明显减少。2、从胃癌癌旁正常组织中成功扩增出S100A2与FAM3B全长基因并克隆入真核表达载体p EGFP-N2中的多克隆位点上,经PCR、酶切反应和测序证实正确。目的基因重组质粒转染胃癌细胞BGC823,激光扫描共聚焦显微镜观察,S100A2与EGFP融合蛋白分布在细胞浆内核膜周围,而FAM3B融合蛋白则位于细胞核内。3、经过G418筛选,成功获得稳定转染的细胞株,经Western blot检验证实S100A2和FAM3B在转染细胞中表达增加。4、HE染色发现胃癌细胞BGC823与转染重组质粒后BGC823细胞的细胞形态没有发生明显变化;转染S100A2与FAM3B重组质粒后,G0/G1期细胞比例增高,S期和G2/M期比例降低;转染S100A2和FAM3B重组质粒后,BGC823细胞的增殖速度明显降低,尤其以FAM3B基因的影响较为明显;转染S100A2后,细胞在单位时间内穿过Transwell的数量明显多于空载体组,具有显著差异性（P＜0.05）;通过检测PARP蛋白的被caspase切割情况,发现S100A2与FAM3B基因转染后,细胞内89KDa片段明显增多。结论1、S100A2基因在胃癌细胞系表达降低,表明该基因可能具有抑癌基因的作用。在细胞浆内表达,但靠近核膜周围。转染后细胞生长增殖速度减慢,增殖指数降低,参与细胞凋亡,但运动能力增强,提示S100A2基因可能通过不同的机制参与了细胞的生长、运动和凋亡。2、FAM3B基因mRNA和蛋白在4株细胞系表达均较弱,虽无明显差异,但细胞化学染色发现GES-1细胞系与胃癌细胞系BGC823表达较多,SGC7901细胞内表达减弱。在GES-1细胞,FAM3B位于细胞浆内,而在BGC823细胞,FAM3B则主要分布在细胞核中。转染后细胞生长增殖速度减慢,增殖指数降低,参与细胞凋亡,提示FAM3B基因可能也是一肿瘤抑制基因。
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