一种定量分析双歧杆菌的新方法

论文摘要

作为人和温血动物体内最重要的益生菌,双歧杆菌对宿主显示了多方面的促进健康作用。目前市场上以含有双歧杆菌的混合菌产品居多,而目前对该类产品却没有一个准确的检测方法。本文旨在建立一种新的双歧杆菌定量分析技术。论文首先建立了双歧杆菌的培养体系,两歧双歧杆菌的培养结果显示:BBL琼脂培养基和TPY液体培养基对两歧双歧杆菌的培养效果较好,作为两歧双歧杆菌的培养基。然后进行了双歧杆菌属特征性酶F6PPK测定条件的优化。试验首先改良了原初文献(Scardovi法)F6PPK酶活测定中对照反应管的设置,又对双歧杆菌培养时间、细胞破碎方法、底物浓度、比色波长、反应温度与时间等条件进行了优化。结果表明,双歧杆菌培养18 h,收集菌体,以超声波法破碎细胞制备粗酶液,采用4 %的底物浓度,将粗酶液与底物于40℃保温30 min,最终反应物于500 nm比色,所得F6PPK酶活测定结果更可靠。在获得优化的F6PPK酶活力测定条件的基础上,通过培养不同的时间来获取不同数量的菌体,用厌氧箱法对双歧杆菌进行平板菌落计数,用优化过的酶活测定方法测定F6PPK酶活力,分别建立了两歧双歧杆菌和长双歧杆菌的菌数与酶活力的对应关系的工作曲线。并用市场上的产品对工作曲线进行了验证,结果与平板计数法的结果一致。证明该方法是一种可靠的双歧杆菌的定量分析方法。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 益生菌
• 1.2 双歧杆菌的研究历史与现状
• 1.3 双歧杆菌的生物学特征
• 1.4 双歧杆菌的生物学作用
• 1.4.1 营养与促机体生长作用
• 1.4.2 免疫增强
• 1.4.3 维持肠道微生态平衡、预防和治疗肠道消化疾病
• 1.4.4 抗衰老作用
• 1.4.5 降低血脂和胆固醇作用
• 1.4.6 抗肿瘤作用
• 1.5 双歧杆菌的培养
• 1.5.1 双歧杆菌对营养的要求
• 1.5.2 双歧杆菌培养中隔氧的方法
• 1.5.2.1 亨盖特厌氧滚管技术
• 1.5.2.2 厌氧箱法
• 1.6 双歧杆菌的特征性酶
• 1.7 双歧杆菌的鉴定
• 1.8 双歧杆菌的定量分析
• 1.8.1 平板计数法
• 1.8.2 以PCR 技术为特征的分子检测
• 1.8.3 其它的双歧杆菌的定量分析方法
• 1.9 双歧因子的研究
• 1.10 双歧杆菌微胶囊的研究
• 1.11 双歧杆菌的应用研究
• 1.12 双歧杆菌的安全性研究
• 1.13 双歧杆菌研究存在的问题及对策
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 菌种
• 3.2 试剂
• 3.3 培养基
• 3.4 主要仪器
• 3.5 方法
• 3.5.1 双歧杆菌培养体系的确立
• 3.5.2 F6PPK 测定条件的优化
• 3.5.2.1 粗酶液的制备
• 3.5.2.2 F6PPK 酶活力的测定
• 3.5.3 双歧杆菌工作曲线的建立
• 3.5.3.1 两歧双歧杆菌工作曲线的建立
• 3.5.3.2 长双歧杆菌工作曲线的建立
• 3.5.4 F6PPK 法定量分析双歧杆菌的验证
• 3.5.4.1 长双歧杆菌工作曲线的验证
• 3.5.4.2 两歧双歧杆菌工作曲线的验证
• 4 结果与分析
• 4.1 两歧双歧杆菌培养体系的建立
• 4.2 双歧杆菌F6PPK 酶活测定体系的建立
• 4.2.1 双歧杆菌F6PPK 的检出
• 4.2.2 对照反应管的不同设置对F6PPK 酶活力测定结果的影响
• 4.2.3 培养时间对F6PPK 酶活力的影响
• 4.2.4 细胞破碎方法对F6PPK 酶活力的影响
• 4.2.5 底物浓度对F6PPK 酶活力的影响
• 4.2.6 反应物最大比色波长的确定
• 4.2.7 反应温度对F6PPK 酶活力的影响
• 4.2.8 反应时间对F6PPK 酶活力的影响
• 4.2.9 优化法与Scardovi 改良法所测F6PPK 酶活力的比较
• 4.3 双歧杆菌的活菌数-F6PPK 酶活力工作曲线的建立
• 4.3.1 两歧双歧杆菌的工作曲线的建立
• 4.3.2 长双歧杆菌的工作曲线的建立
• 4.4 F6PPK 法定量分析双歧杆菌类产品的验证
• 5 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 5.2.1 F6PPK 酶活测定中对照反应管的设置直接影响到结果的可靠性
• 5.2.2 F6PPK 酶活力测定可以作为双岐杆菌定量分析的一种方法
• 参考文献
• ABSTRACT