论文摘要
研究背景和意义:原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是人类最常见的恶性肿瘤之一,恶性程度高、预后差、死亡率高,全世界每年约有100万人死于肝癌。传统的外科手术和放化疗等治疗手段疗效不理想,尚缺乏特异性的早期诊断标志物。单链抗体（Single chain variable fragment,scFv）分子质量小、穿透力强、体内半衰期短、免疫原性低并且具有亲本抗体相同抗原的结合能力,是肝癌导向治疗较理想的载体。我们课题组采用噬菌体抗体库技术成功地筛选出1株特异性抗肝癌scFv 4-16（GenBank登录号:DQ640759）,并对其进行了体外亲和力成熟及人源化改造,获得了高亲和力人源化抗肝癌scFv HDM。初步研究显示特异性抗肝癌scFv 4-16能与肝癌细胞及肝癌组织抗原特异性结合,具有较好的开发和临床应用前景。但是,特异性抗肝癌scFv 4-16的作用位点（靶抗原）尚不清楚,作用机制也还有待研究。因此,本研究重点筛选和鉴定特异性抗肝癌scFv 4-16识别的靶抗原,明确其作用位点,为肝癌早期诊断、免疫治疗及肿瘤疫苗研究提供新的思路和方法第一部分人肝癌细胞cDNA噬菌体表达文库构建和鉴定目的:构建肝癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库。方法:从肝癌细胞提取总RNA,纯化mRNA,用RT-PCR反转录合成cDNA第一链,LD-PCR合成cDNA第二链,除去＜500bp小片段,与λTriplEx2噬菌体载体连接并体外包装,转化大肠感菌E.coli XL1-blue,测定文库的库容和重组率,PCR鉴定插入cDNA片段大小。结果:构建的肝癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,原始库容为3.4×106pfu/ml,重组率为98.2%;文库扩增后库容为9.6×1011pfu/ml,重组率为97.2%;重组子插入cDNA片段大小600bp～2kb不等,平均1.4kb。结论:成功构建高质量的肝癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,为肝癌特异性抗原的筛选和鉴定奠定了基础。第二部分人源化抗肝癌scFv HDM的优化表达、纯化及生物学活性鉴定目的:优化表达人源化抗肝癌scFv HDM,并鉴定其生物活性。方法:以ITPG诱导大肠杆菌HB2151表达可溶性抗肝癌单链抗体;利用HiTrap Anti-E Tag亲和层析柱对阳性克隆表达的单链抗体进行纯化;纯化后的单链抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,以Bradford检测法测定其浓度,ELISA法及免疫组化法鉴定其生物学活性;结果:在培养基中加入0.4M蔗糖,以IPTG 1mmol/L于30℃诱导12h,抗肝癌scFvHDM可溶性表达量较多,纯化后可溶性抗肝癌scFv含量为325μg/L。纯化的抗肝癌scFvHDM与肝癌组织、肝癌细胞抗原特异性结合,具有良好的生物学活性。结论:成功获得具有生物活性的人源化抗肝癌scFv HDM。第三部分人肝癌细胞cDNA文库的筛选及阳性克隆分析目的:筛选并鉴定特异性抗肝癌scFv 4-16识别的靶抗原。方法:以特异性抗肝癌scFv 4-16、scFv DM、scFv HDM为探针筛选cDNA噬菌体表达文库,并对阳性克隆进行DNA序列测定及生物信息学分析,RT-PCR检测阳性克隆mRNA在各类细胞中的表达。结果:经过三轮筛选获得1株阳性克隆（抗肝癌scFv 4-16G）,DNA序列为833bp,与角蛋白23有99%的同源性;RT-PCR检测显示抗肝癌scFv 4-16G在三种肝癌细胞中表达,在胃癌细胞中弱表达,在L02胎肝细胞中不表达。结论:角蛋白23可能是特异性抗肝癌单链抗体scFv 4-16识别的靶抗原。