红掌漆酶基因Lac的表达载体构建与剑麻的遗传转化

论文摘要

剑麻是亚热带、热带地区重要的麻类作物,具有广阔的综合利用前景。剑麻受生理性病害、虫媒病害和病原菌病害等的侵害,尤其是剑麻斑马纹病的危害,产量大幅度降低。本研究以剑麻无菌苗叶片为材料,优化了剑麻愈伤组织诱导的培养基配方。同时,提取红掌RNA并反转录成cDNA,扩增获得漆酶基因Lac的cDNA,将Lac基因取代pBI121中的GUS基因构建了植物表达载体pBI121-Lac。通过农杆菌介导的方法将Lac基因导入剑麻基因组,并通过PCR和RT-PCR方法对转基因植株进行了检测。主要结论如下：（1）优化了剑麻的再生培养基,其各阶段的培养基配方分别为：MS+6-BA2.0mg/L+NAAO.1 mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L卡拉胶,pH值为5.8；芽分化培养基为：MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L卡拉胶,pH值为5.8；芽伸长培养基为：MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.01 mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L卡拉胶,pH值为5.8；生根培养基为：MS+IAA 0.1 mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L卡拉胶,pH值为5.8。（2）摸索出了农杆菌介导的的剑麻的遗传转化的多种因素,筛选出潮霉素Hyg的致死浓度为25 mg/L,半致死浓度为15 mg/L；农杆菌菌液浓度OD600值为0.6时转化率最高；农杆菌侵染的时间控制在10-15 min；共培养培养基中加入乙酰丁香酮As的浓度为200μgmol/L；选择培养培养基中加入羧苄青霉素Car的浓度为400 mg/L。（3）将红掌RNA反转录成cDNA,并扩增获得漆酶基因Lac的cDNA全长。（4）将漆酶基因Lac取代pBI121中GUS基因的位置并构建了植物表达载体pBI121-Lac。（5）通过农杆菌介导的方法将漆酶基因Lac导入剑麻基因组,用PCR和RT-PCR方法检测到Lac基因已经整合到剑麻基因组并表达,剑麻叶片出现红色斑点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 剑麻的研究进展
• 1.1.1 剑麻生产概况
• 1.1.2 剑麻的综合利用
• 1.1.3 剑麻的病虫害
• 1.2 植物基因工程技术
• 1.3 现代生物技术在剑麻育种中的应用
• 1.3.1 组织培养
• 1.3.2 种质资源
• 1.3.2.1 剑麻种质资源概况
• 1.3.2.2 剑麻种质资源的研究概况
• 1.3.3 遗传转化
• 1.4 pBI121-Lac转化剑麻
• 1.4.1 Lac基因
• 1.4.2 GUS基因
• 1.5 本研究的目的和意义
• 1.6 本研究的技术路线
• 2 剑麻组织培养体系的优化
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要仪器与试剂
• 2.1.3 基本培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 愈伤组织诱导培养基的优化
• 2.2.2 愈伤组织诱导出芽培养基的优化
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 愈伤组织诱导培养基的优化
• 2.3.2 愈伤组织诱导出芽培养基的优化
• 3 剑麻遗传转化体系的因子优化
• 3.1 材料
• 3.1.1 培养基
• 3.1.2 主要试剂配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 农杆菌介导的剑麻转化方法
• 3.2.2 潮霉素（Hyg）基础抗性测定
• 3.2.3 菌液浓度对转化的影响
• 3.2.4 侵染时间对转化的影响
• 3.2.5 乙酰丁香酮（As）的浓度对转化的影响
• 3.2.6 羧苄青霉素（Car）浓度对诱导愈伤的影响
• 3.2.7 GUS组织化学染色
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 潮霉素（Hyg）基础抗性测定
• 3.3.2 菌液浓度对转化的影响
• 3.3.3 侵染时间对转化的影响
• 3.3.4 乙酰丁香酮的浓度对转化的影响
• 3.3.5 羧苄青霉素（Car）浓度对诱导愈伤的影响
• 3.3.6 GUS组织化学染色
• 4 漆酶基因cDNA的获得与酶切位点的添加
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 菌株和载体
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 试剂盒
• 4.1.5 内切酶
• 4.1.6 引物
• 4.1.7 主要仪器与试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 红掌RNA的提取
• 4.2.2 红掌cDNA的获得
• 4.2.3 漆酶cDNA全长的PCR扩增
• 4.2.4 漆酶cDNA酶切位点的添加及目的片段的回收
• 4.2.4.1 漆酶cDNA酶切位点的添加
• 4.2.4.2 目的片段的回收
• 4.2.5 大肠杆菌感受态的制备
• 4.2.6 连接转化
• 4.2.7 菌落PCR
• 4.2.8 质粒pT-Lac的提取与酶切鉴定
• 4.2.8.1 质粒pT-Lac的提取
• 4.2.8.2 质粒pT-Lac的双酶切
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 漆酶cDNA全长的PCR扩增
• 4.3.2 漆酶cDNA酶切位点的添加与目的片段的回收
• 4.3.3 菌落PCR结果
• 4.3.4 质粒pT-Lac的提取与酶切鉴定
• 5 表达载体pBI121-Lac的构建
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 内切酶及连接酶
• 5.1.4 主要试剂配制
• 5.2 方法
• 5.2.1 质粒pBI121的提取
• 5.2.2 质粒pBI121的SacⅠ和XbaⅠ双酶切
• 5.2.3 表达载体pBI121-Lac的构建
• 5.2.3.1 质粒pT-Lac与pBI121连接转化
• 5.2.3.2 重组子鉴定
• 5.2.3.3 质粒pBI121-Lac的提取与酶切鉴定
• 5.2.3.4 农杆菌感受态的制备
• 5.2.3.5 农杆菌转化
• 5.2.3.6 菌落PCR
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 质粒pT-Lac与pBI121的双酶切
• 5.3.2 质粒pBI121-Lac的提取与酶切鉴定
• 6 剑麻的遗传转化
• 6.1 转基因植株的PCR检测
• 6.1.1 材料
• 6.1.1.1 植物材料
• 6.1.1.2 试剂
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 剑麻基因组DNA的提取
• 6.1.2.2 PCR检测
• 6.1.2.3 目的片段的回收
• 6.1.2.4 连接转化
• 6.1.3 结果与分析
• 6.1.3.1 剑麻的遗传转化过程
• 6.1.3.2 转基因剑麻的PCR检测
• 6.2 转基因植株的RT-PCR检测及形态变化
• 6.2.1 材料
• 6.2.1.1 试剂盒
• 6.2.1.2 引物
• 6.2.2 方法
• 6.2.2.1 剑麻RNA的提取
• 6.2.2.2 1st-Strand cDNA的合成
• 6.2.2.3 反转录产物检测
• 6.2.2.4 目的基因的PCR检测
• 6.2.3 结果与分析
• 6.2.3.1 剑麻RNA提取
• 6.2.3.2 cDNA的质量检测
• 6.2.3.3 反转录产物的检测
• 6.2.3.4 反转录产物的检测
• 7 讨论
• 7.1 继代次数对剑麻增殖的影响
• 7.2 影响遗传转化的因素
• 7.2.1 乙酰丁香酮（As）对基因转化的影响
• 7.2.2 农杆菌菌株对基因转化的影响
• 7.3 瞬时表达与稳定表达
• 7.4 漆酶的研究
• 8 结论
• 参考文献
• 致谢