多功能p100蛋白对细胞周期的调控机制研究

论文摘要

研究目的：细胞周期是细胞生命活动的基本特征。细胞通过周期时相的变迁完成个体的发育和自我的更新,其核心内容为DNA的复制以及相关蛋白时序性的转录表达。p100蛋白是一种多功能蛋白,不但可以作为转录共激活因子,与若干转录因子相互作用激活转录；在转录后的调控中,p100蛋白通过参与pre-mRNA剪接,RNAi等环节发挥重要作用；p100蛋白还与和细胞周期密切相关的核仁存在共定位现象；另外,在一些临床疾病的研究中,发现p100在肿瘤的发生发展中扮演重要角色。鉴于两者均与基因转录、pre-mRNA剪接加工、核仁以及肿瘤的发生密切相关,我们推测p100蛋白有可能参与细胞周期的调控,从而对细胞的生物学行为产生影响。本文旨在研究p100对细胞周期的影响,进而探讨其调控细胞周期的分子机制。方法：本课题分三部分进行,第一部分研究不同细胞群中p100的表达。该部分主要从两方面研究,一方面,采用细胞分离技术,于白膜中分离淋巴细胞和粒细胞,检测两种细胞群中p100的表达情况；另一方面,取不同的组织,观察不同增殖能力的细胞群间p100的表达差异。第二部分,改变p100的表达水平,研究p100对细胞周期分布及同步化释放后再分布的影响,同时检测细胞周期调控网络中其他周期蛋白的变化,探讨其调控细胞周期的分子机制。第三部分,采用细胞同步化技术,研究p100在不同细胞周期的特点。该部分主要从三方面研究,第一通过WB与PCR技术检测p100在不同周期时相的表达；第二采用免疫沉淀技术,检测不同周期p100蛋白的修饰；第三采用免疫荧光技术观察不同周期p100的胞内定位。结果：①淋巴细胞中p100高表达,粒细胞中p100低表达；②增殖细胞群（G1期细胞）肿瘤细胞中,p100高表达；暂不增殖细胞群（GO期细胞）肝、脾、肾组织中,p100高表达；终末细胞群粒细胞、肌细胞、神经组织中,p100低表达。③抑制p100表达,G1期细胞比例增加,S期细胞比例降低；过表达p100,G1期细胞比例降低,S期细胞比例增加。④抑制p100表达,将细胞由G1/S交界期及G2/M期释放,与对照组及过表达组相比,细胞重新进入细胞周期的速度减慢。⑤将细胞同步化于不同周期,发现p100蛋白可表达于细胞周期各个阶段,以G1/S期表达水平较低；⑥通过免疫沉淀富集p100蛋白,检测其磷酸化水平,结果显示当细胞阻滞于G1/S期,p100蛋白磷酸化水平明显降低。⑦免疫荧光观察,p100蛋白在不同周期状态下的分布呈现动态变化,与核仁在细胞周期的分布相一致。结论：①在细胞周期活跃的细胞群中,p100高表达；在终末期细胞群中,p100低表达。说明p100蛋白与细胞周期特性密切相关。②p100蛋白可促进细胞周期进程,且主要是促进G1期向S期的周期进程。③p100蛋白可表达于细胞周期各个阶段,以G1/S期表达水平较低,且磷酸化水平明显降低。进一步说明p100对细胞周期的调控发生在G1/S期,提示p100可能通过磷酸化状态的改变发挥作用。④p100蛋白在不同周期时相的分布呈动态变化,与核仁的周期分布相一致。提示p100蛋白可能与核仁协同作用参与核糖体的形成,调控细胞周期。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、p100蛋白在不同细胞群的表达
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 细胞
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要溶液、缓冲液与培养基
• 1.1.4 主要仪器、设备
• 1.1.5 实验方法及流程
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、p100蛋白在细胞周期不同时相的特点
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 细胞
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要溶液、缓冲液与培养基
• 2.1.4 仪器设备
• 2.1.5 实验方法及流程
• 2.1.6 实验方法及流程
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、p100蛋白调控细胞周期的机制研究
• 3.1 对象和方法
• 3.1.1 细胞
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要溶液、缓冲液与培养基
• 3.1.4 仪器设备
• 3.1.5 实验方法及流程
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 综述参考文献
• 致谢