论文摘要
动物实验和临床研究表明,脑缺血后继发的急慢性炎症加剧脑损伤。5-脂氧酶（5-lipoxygenase,5-LOX）是催化花生四烯酸生成炎症介质白三烯（leukotrienes,LTs）的关键酶。白三烯包括白三烯B4（leukotriene B4,LTB4）和半胱氨酰白三烯（cysteinylleukotrienes,CysLTs,包括LTC4、LTD4和LTE4）,是体内一类重要的炎症介质,介导白细胞趋化、平滑肌痉挛、微血管渗漏等反应,参与多种炎症性疾病的病理过程。早期有关5-LOX的研究主要集中在哮喘、过敏性鼻炎等外周疾病。近年来研究发现,5-LOX和半胱氨酰白三烯受体1（cysteinyl leukotriene receptor 1,CysLT1）在中枢神经系统表达,增加血脑屏障通透性和促进脑水肿形成,参与脑缺血、脑外伤、脑肿瘤等疾病的病理生理过程。脑缺血急性和亚急性期,脑内5-LOX表达及其代谢产物白三烯含量显著增加。5-LOX抑制剂[如AA861、MK-886、去甲二氢愈创木酸（nordihydroguaiaretic acid,NDGA）、咖啡酸（caffeic acid,CA）]以及CysLT1受体拮抗剂（如普鲁司特、孟鲁司特等）对脑缺血损伤有保护作用。脑缺血后期的主要特征之一是梗死周边区反应性胶质增生（主要由星形胶质细胞组成）和胶质疤痕形成,形成轴突再生的物理/生化屏障。最近我们实验室的研究发现,大鼠局灶性脑缺血损伤后期,5-LOX和CysLT1受体表达增加,主要定位在梗死周边区的星形胶质细胞上,介导星形胶质细胞增殖和胶质疤痕的形成。5-LOX抑制剂咖啡酸和CysLT1受体拮抗剂普鲁司特能抑制梗死周边区星形胶质细胞增殖,对脑缺血慢性损伤有保护作用。另外,近来有文献报道编码5-LOX激活蛋白（5-lipoxygenase-activating protein,FLAP）基因可增加脑卒中的风险。上述研究表明5-LOX参与脑缺血损伤的早期炎症和后期修复过程,可能是治疗脑缺血损伤的一个潜在较好靶点。但是,5-LOX如何参与脑缺血后炎症过程,是否由CysLT1受体介导?目前尚不清楚。另一方面,米诺环素是半合成的第二代四环素类抗生素。近年来发现,米诺环素有不依赖抗菌作用的抗炎效应。1998年首次报道米诺环素对全脑缺血的保护作用后,大量研究表明米诺环素对多种神经系统疾病有保护作用,如脑卒中、多发性硬化、脊髓损伤、帕金森病、亨廷顿病和脊髓侧索硬化等。米诺环素的神经保护机制与抗炎和抗凋亡等有关。如米诺环素能抑制小胶质细胞激活和增殖、诱生型一氧化氮合酶（iNOS）,白介素1β转化酶（ICE）和环氧酶-2（COX-2）的表达、以及caspase依赖和非依赖的细胞凋亡通路。最近,我们离体实验研究发现,米诺环素对培养的PC12细胞缺血样损伤和NMDA诱导的细胞毒性具有保护作用,同时能抑制5-LOX转位到核膜（5-LOX激活）。提示米诺环素对PC12细胞缺血样损伤和NMDA诱导的细胞毒性有保护作用,部分是通过抑制5-LOX激活实现。在整体脑缺血模型中,米诺环素是否通过抑制5-LOX表达和激活发挥抗脑缺血损伤作用尚不清楚。综上所述,目前在整体水平尚有以下问题未阐明:（1）5-LOX参与脑缺血后炎症的特点是什么?（2）5-LOX是否通过CysLT1受体介导脑缺血后炎症反应?（3）米诺环素是否通过抑制5-LOX激活减轻炎症、改善修复过程及促进神经功能恢复。因此,本研究拟在大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型阐明上述问题。第一部分5-脂氧酶/半胱氨酰白三烯受体1通路介导大鼠脑缺血后炎症反应目的:观察5-LOX参与脑缺血损伤后炎症的特点及其是否通过CysLT1受体介导。方法:线栓法诱导大鼠大脑中动脉阻塞模型,缺血30min再灌72h,观察5-LOX抑制剂NDGA（10 mg/kg）和CysLT1拮抗剂普鲁司特（0.1mg/kg）对脑缺血损伤的保护作用;应用免疫组化方法观察脑缺血后IgG渗出、中性粒细胞和巨噬细胞/小胶质细胞浸润、ICAM-1和P-选择素表达情况;同时应用酶联免疫方法检测半胱氨酰白三烯（CysLTs）和白三烯B4（LTB4）含量。结果:NDGA和普鲁司特能改善脑缺血后的神经功能,减少梗死体积,减少IgG渗出,抑制中性粒细胞浸润,减少粘附分子ICAM-1表达;NDGA还能显著抑制P-选择素表达,减少CysLTs和LTB4含量;但两者都不能抑制巨噬细胞/小胶质细胞浸润。结论:局灶性脑缺血后炎性细胞浸润,血脑屏障通透性和粘附分子表达增加,同时5-LOX产物含量增加;5-LOX抑制剂和CysLT1受体拮抗剂部分抑制炎症反应。结果表明5-LOX部分通过CysLT1受体参与炎症反应。第二部分米诺环素抑制大鼠局灶性脑缺血损伤后5-LOX激活和炎症反应目的:观察米诺环素对大鼠局灶性脑缺血的抗炎作用是否是通过抑制5-LOX表达和激活实现。方法:MCAO 30min后再灌注72h,米诺环素（22.5,45mg/kg）连续给药3天,观察缺血损伤情况、内源性IgG渗出、中性粒细胞和巨噬细胞/小胶质细胞浸润;同时采用免疫组化和RT-PCR检测5-LOX蛋白和mRNA表达情况,免疫荧光双标法观察5-LOX的细胞定位,再灌后3h用酶联免疫方法检测白三烯含量。结果:米诺环素能改善脑损伤,减少IgG渗出、中性粒细胞和巨噬细胞/小胶质细胞的聚集;5-LOX在缺血中心区主要表达在神经元上,而在缺血周边区可表达在星形胶质细胞和小胶质细胞上;米诺环素能显著抑制5-LOX蛋白、mRNA表达和白三烯产物。结论:米诺环素抑制脑缺血后炎症的作用部分通过抑制5-LOX表达和激活。第三部分米诺环素抑制大鼠脑缺血慢性期5-LOX表达和促进神经功能恢复目的:观察米诺环素对脑缺血慢性期的保护作用及其与5-LOX表达之间的关系。方法:MCAO 60 min后再灌注36 d,米诺环素（45 mg/kg）连续给药6 d,在脑缺血后1～28 d分别采用肢体放置实验、错步实验、粘胶揭除实验评价大鼠感觉运动功能,脑缺血后30～35 d用八臂迷宫评价大鼠认知功能;组织学评价梗死体积和神经元存活;用免疫组化方法观察脑缺血后36 d胶质细胞增殖和5-LOX表达情况。结果:米诺环素能显著促进大鼠脑缺血慢性期感觉运动和认知功能恢复,但对梗死体积无影响。大鼠脑缺血后36 d 5-LOX表达显著增加,在梗死周边区主要定位在增殖的星形胶质细胞上,在梗死核心区主要表达在巨噬细胞/小胶质细胞上,米诺环素能显著抑制胶质细胞增殖和5-LOX表达。结论:米诺环素能促进大鼠脑缺血慢性期神经功能恢复,与抑制5-LOX表达减少胶质细胞增殖有关。结论1.大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤72 h,5-LOX抑制剂NDGA和CysLT1受体拮抗剂普鲁司特能抑制脑缺血后脑内炎症反应。提示5-LOX参与脑缺血后炎症可能部分通过CysLT1受体介导。2.大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤72 h,5-LOX表达和激活增加,米诺环素能显著抑制5-LOX表达和激活,并减弱缺血后炎症反应。提示米诺环素抑制脑缺血后炎症反应可能部分通过抑制5-LOX表达和激活。3.大鼠脑缺血/再灌注损伤36 d,米诺环素能促进大鼠脑缺血慢性期感觉运动和认知功能恢复,并能抑制梗死周边区星形胶质细胞和核心区巨噬细胞/小胶质细胞增殖,抑制胶质疤痕形成,并显著抑制增殖的星形胶质细胞上5-LOX表达。提示米诺环素可通过抑制5-LOX表达,而抑制胶质细胞增殖和胶质疤痕形成,促进神经功能恢复。4.本研究为米诺环素在脑缺血等中枢神经疾病治疗方面,为其作用特点及机制提供了新的实验依据。
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