论文摘要
目的:通过骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic proteins 2,BMP-2）基因转染以增加组织细胞BMP-2蛋白的分泌量,提高BMP-2蛋白在生物体骨折局部组织中的浓度,达到促进骨折愈合的目的已经成为现实。但是,如何提高质粒对于靶组织的转染效率、寻求一种高效、简便的转染手段,如何缩短鉴定转染是否成功的时间,以及在基因转染促进骨愈合的过程中,采用不同的转染时间、不同的转染频率和不同的转染剂量与促进骨折愈合效果之间的关系,一直未得到很好的阐明。本研究包括:1)建立稳定的、基因序列正确的、检测方便的、含有BMP-2基因的pIRES2-增强绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent protein, EGFP）-BMP-2真核表达质粒并检测其转染NIH3T3细胞的效率及转染后的生物学活性;2)从兔的股骨、胫骨中获得骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells, BMSCs）,培养、传代后使用pIRES2-EGFP-BMP-2质粒进行转染,以了解该质粒转染兔骨髓间充质干细胞的效率及转染后的生物学活性;3)探讨使用基因枪对兔桡骨骨折周围组织进行pIRES2-EGFP-BMP-2质粒转染、导入的有效性,并研究在不同时间、采用不同剂量、不同导入频率进行基因枪介导的BMP-2基因转染与兔桡骨骨折愈合之间的关系。方法:1)本课题第一部分:将BMP-2cDNA基因片段和pIRES2-EGFP载体两种质粒分别用EcoR I、BglⅡ作双酶切,采用T4DNA连接酶连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α。扩增提取重组质粒pIRES2-EGFP-BMP-2,纯化处理后,用限制性核酸内切酶进行酶切、电泳鉴定,并送上海生工生物工程技术服务有限公司作测序鉴定。复苏NIH3T3细胞,传代、培养后采用LipofectamineTM2000转染试剂介导进行pIRES2-EGFP-BMP-2质粒转染NIH3T3细胞,转染24小时后取部分细胞在倒置荧光显微镜下观察结果。其余部分用含G418的DMEM培养液筛选后搜集细胞,进行BMP-2蛋白的western blot检测,对其转染效果进行鉴定。2)本课题第二部分:采用取自2只新西兰大白兔的新鲜股骨、胫骨标本,剪除骨骺端后,穿刺骨髓、抽取骨髓经离心后获取单个核细胞,传至第3代时进行Lipofectamine TM 2000介导的pIRES2-EGFP-BMP-2质粒转染。转染24小时后取部分细胞在倒置荧光显微镜下观察结果。其余部分用含G418的DMEM培养液进行筛选,4周后搜集细胞,进行BMP-2蛋白的western blot检测。3)本课题第三部分:采用健康新西兰大白兔119只,随机分为7组,每组17只。采用耳缘静脉麻醉后,手术区域剔除毛发,强力碘消毒、铺无菌巾单,取左前臂背侧3厘米切口逐层切开,采用微创显露技术以尽量少干扰骨折周围组织,直至切开骨膜,显露桡骨中段,以线锯造成桡骨中段的横行骨折。所有动物模型制作均由同一位操作者完成。根据不同的组别施以干预措施。5μg组:手术造成骨折后立即给予5μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒轰击骨折区及周围组织;10μg组:手术造成骨折后立即给予10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒轰击骨折区及周围组织; 3天后10μg组:手术当时仅造成骨折,然后关闭手术切口。3天后再次沿原手术切口切开显露骨折部位,给予10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒轰击骨折区及周围组织;3天后0μg组:手术当时仅造成骨折,然后关闭手术切口。3天后再次沿原手术切口切开显露骨折部位,给予10μg pIRES2-EGFP空白质粒轰击骨折区及周围组织;14天后再次10μg组:本组大白兔在手术造成骨折后立即给予10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒轰击骨折区及周围组织,14天后再次沿原手术切口显露骨折,再给予同一部位一次10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒的轰击;14天后再次0μg组:本组大白兔在手术造成骨折后立即给予10μg pIRES2-EGFP- BMP-2质粒轰击骨折区及周围组织,14天后再次沿原手术切口显露骨折,再给予同一部位一次10μg pIRES2-EGFP空白质粒的轰击。对照组（0μg组）:手术造成骨折后立即给予不含BMP-2基因的10μg pIRES2-EGFP空白质粒轰击作为对照。各组于手术后1周时,随机处死2只实验动物,取骨折区周围软组织,行BMP-2蛋白的Western blot检测,观察BMP-2蛋白表达情况。术后4、6、8和12周进行X光片摄片观察骨折线变化、骨痂生长及骨髓腔再通情况,并在X光片提示骨折已经愈合（骨折线消失）时随机处死该骨折愈合组中2只动物,进行大体标本的观察。结果:1)重组质粒pIRES2-EGFP-BMP-2经EcoRI BglⅡ双酶切、电泳后,出现了1.2kbp和5.3kbp两条带,分别为BMP-2cDNA片段和pIRES2-EGFP载体片段,说明目的基因片段已连接到载体上;合成的质粒测序结果经NCBI中的BLAST软件分析,其核酸序列与Gene Bank中hBMP-2的mRNA序列（NM 001200）的编码序列相符,说明构建质粒的hBMP-2基因序列正确。经pIRES2-EGFP-BMP-2转染后的NIH3T3细胞在倒置荧光显微镜下观察显示增强绿色荧光蛋白阳性,Western blot检测显示在相对分子质量（Mr）为30×103处显现单一特异性条带,证明有BMP-2蛋白的表达。2 )从实验动物兔股骨及胫骨中成功获得了兔骨髓间充质干细胞, LipofectamineTM2000介导的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞24小时后,倒置荧光显微镜下显示转染后的兔骨髓间充质干细胞内可见绿色荧光蛋白的持续表达,绿色荧光蛋白分布于整个细胞,呈胞浆分布。Western blot检测显示转染后的兔骨髓间充质干细胞在相对分子质量（Mr）为30×103处显现单一特异性条带,说明有BMP-2蛋白的表达。3)经基因枪介导pIRES2-EGFP-BMP-2质粒转染的实验动物,在骨折后7天,实验动物骨折部位周围软组织的Western blot检测显示BMP-2蛋白表达阳性,并且量明显增多。实验动物桡骨骨折愈合过程的X线4周、6周、8周、12周观察显示,5μg组、对照组（0μg组）较10μg组的骨折线消失时间延长、骨痂形成量差、骨髓腔再通时间延长;3天后10μg组与3天后0μg组相比,3天后10μg组骨折线消失时间缩短、骨痂形成量好、骨髓腔再通时间缩短:3天后10μg组与10μg组相比,在骨折线消失的时间、骨痂形成的质量及骨髓腔再通的时间上无明显差异;14天后再次10μg组与14天后再次0μg组相比,在骨折线消失的时间、骨髓腔再通的时间上无明显差异,但是在骨痂的形成质量上优于14天后再次0μg组及其他各组。结论:1)含有BMP-2基因序列的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒构建成功并具有转录活性。2)兔骨髓间充质干细胞可被真核表达质粒pIRES2-EGFP-BMP-2转染并能在骨髓间充质干细胞中翻译、表达产生BMP-2蛋白。3)含有BMP-2基因的pIRES2-EGFP-BMP-2质粒可以被基因枪成功导入兔桡骨周围的组织细胞中,并可在其内翻译、表达BMP-2蛋白。使用基因枪将BMP-2基因导入兔桡骨骨折周围组织以促进骨折愈合时,可以明显缩短骨折的愈合时间、提高骨痂的生成质量、缩短骨髓腔的再通时间。分别采用0μg、5μg、10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒导入促进骨折愈合时,在骨折愈合时间、骨痂生成量、骨髓腔再通时间上,随导入质粒剂量的增加而效果逐渐明显。延迟于骨折当时3天进行10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒导入时,其在骨折愈合时间、骨痂生成量、骨髓腔再通时间上与骨折当时进行质粒导入没有区别。骨折当时、骨折后14天两次进行10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒导入以促进骨折愈合时,骨折愈合时间、骨髓腔再通时间上与骨折当时、单次质粒导入没有区别,但是该实验组动物骨痂的生成质量得到了改善。