DNase B基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

论文摘要

DNase B是A族溶血性链球菌的一种分泌蛋白,序列高度保守,几 乎存在于所有A族β-溶血性链球菌中,可用于抗DNA酶B的检测。抗 DNA酶B检测是Jones标准所推荐的链球菌感染及其并发症的两种实验 诊断方法之一。然而,A族β-溶血性链球菌的液体培养需要微需氧条件, 而且存在高致病性,纯化天然DNase B危险大,工艺复杂,成本高,不 利于大量临床检测的开展。为此,本实验克隆了DNase B基因,构建了 一个原核表达载体,并且成功的在大肠杆菌中表达了这个蛋白。 本实验通过PCR方法扩增出DNase B基因,连接入T载体,测序结果证实序列正确。再次PCR,用KpnI、HindIII双酶切PCR产物,后与同样酶切的pET-41a（+）连接,转化大肠杆菌BL21（DE3）。提取转化子质粒,菌落PCR及酶切鉴定证实DNase B基因片段插入表达载体,测序结果表明本实验所克隆的DNase B基因与GenBank中登录的基因序列同源性在98%以上。表达菌用1mmol/L的IPTG诱导4小时,收集菌体,破菌,离心,分离上清和包涵体。SDS-PAGE显示,目的蛋白主要以可溶蛋白的形式存在,部分以包涵体形式存在。上清经Ni-NTA凝胶亲和层析,纯度达到91.5%以上。Western-blotting结果显示,重组的GST-DNase B融合蛋白能够特异的与GAS感染患者的阳性血清反应,在55KD处有一条明显的条带。ELISA实验显示重组蛋白的抗原特异性良好。说明本实验表达的融合蛋白的具有良好的免疫反应性。为抗DNase B抗体的检测及疫苗研制打下坚实的基础。

论文目录

• 内容提要
• 英文摘要
• 序言
• 文献回顾
• 1.A族β—溶血性链球菌概况及研究现状
• 2.DNase B研究进展及意
• 3.大肠杆菌表达系统
• 实验内容
• 1.DNase B基因的克隆及原核表达载体的构建
• 2.DNase B在大肠杆菌中的表达
• 结论
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 中文摘要