基于公共序列数据库的Cucumis属EST-SSR标记的鉴定、开发和利用

论文摘要

SSR标记具有重复性好、多态性高、呈共显性遗传、数量丰富和遍布整个基因组等优点，这些优点使得SSR标记成为广泛使用的分子标记之一，然而按照传统的方法开发SSR标记不仅费时费力而且效率低。随着功能基因组学的发展，EST因为可以用于新基因的发现、基因表达调控研究和基因芯片的底物而被大量测序，并保存在公共序列数据库中，这些EST为SSR等分子标记的开发提供了丰富的序列资源。基于EST序列开发的EST-SSR标记与传统的SSR标记相比有很多优点，如：EST-SSR标记在相关物种之间具有很高的可转移性；EST-SSR标记通常都代表着某种功能，这种功能可以通过序列同源性比对获得；由于利用的是公共序列，EST-SSR标记的开发过程简单成本低；EST-SSR能够反映出转录区的差异，这使得EST-SSR在种质遗传多样性分析、分子标记辅助选择和比较作图等研究中具有更高的使用价值。Cucumis属包括甜瓜（Cucumis melo．L）和黄瓜（Cucumis sativus．L）两种重要的蔬菜作物，这两种蔬菜在世界上广泛种植，具有重要的经济价值，开发黄瓜和甜瓜上可用的EST-SSR标记对于这两种作物的遗传育种研究有着重要的意义。我们利用数据挖掘技术对公共序列数据库中的黄瓜和甜瓜EST上的SSR位点进行了鉴定和分布特征分析，开发了42个具有多态性的EST-SSR标记，评价了这些标记在Cucumis属种质系统发生关系研究中的应用，获得了以下结果：从GenBank中共获得了5563条来自于黄瓜的EST和基因序列以及5748条来自于甜瓜的EST和基因序列。对这些序列分别进行组装，获得3627条黄瓜的Unigene，其覆盖长度为2.2Mb；3189条甜瓜Unigene，覆盖长度为1.8Mb。以重复基序长度为2～6bp、最低重复次数5次为标准，在Unigene上搜寻SSR位点，在黄瓜上获得了479个SSR位点，其发生频率为1／4.6kb；在甜瓜上获得385个SSR位点，其发生频率为1／4.7kb。黄瓜和甜瓜的EST-SSR具有很多共同的特征：在SSR位点中，主要是二核苷酸重复，其次是三核苷酸重复；在二核苷酸重复中，主要的基序类型是AG，其次是AT；在三核苷酸重复中，主要基序类型是AAG；位于CDS区的SSR位点数量最多，其次是5’UTR和3’UTR；卡方检验表明，三核苷酸基序在CDS区和UTR区是随机分布的，而二核苷酸基序并不是随机分布，其在UTR区的分布密度要极显著地高于在CDS区的分布密度，在甜瓜上3’UTR区的EST-SSR数量要极显著地高于5’UTR，表明二核苷酸重复基序和三核苷酸重复基序在CDS和UTR区的选择压力不同。在黄瓜上选择了54个SSR位点合成侧翼引物，在12个黄瓜基因型上评价这些SSR位点的多态性，其中有2对引物无扩增产物；3对引物有非特异性产物；26对引物扩增出了特异性产物，但并无多态性；23对引物在20个位点上扩增出了特异性的具有多态性的产物。在多态性EST-SSR位点上最多检测到了6个等位基因，平均每个位点能够检测到3.3个等位基因，平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为0.404和0.465，有13个EST-SSR位点显著地偏离Hardy-Weinberg平衡（P＜0.05），有10个多态性EST-SSR位点所在的EST序列与已知的功能基因或核苷酸序列有显著的同源性。可转移性分析表明，有13个引物对在甜瓜上有特异性扩增产物，占总数的65％，其中有7个（35％）引物对在测试的甜瓜基因型上表现出多态性。在甜瓜上共合成56对EST-SSR引物，其中4对引物无扩增产物；5对引物有非特异性扩增产物；25对引物有特异性扩增产物，但无多态性；22对引物扩增出特异性的多态性产物。这22对引物在27个黄瓜基因型上最多检测到了5个等位基因，平均每个位点检测到2.9个等位基因，平均观测杂合度为0.340，平均期望杂合度为0.442。有17个EST-SSR位点显著的偏离Hardy-Weinberg平衡。在CM01和CM33，CM16和CM33之间有显著的连锁不平衡关系存在（P＜0.05）。有13个多态性EST-SSR位点所在的EST序列与已知的功能基因或核苷酸序列有显著的同源性。可转移性分析表明，有15个引物对在黄瓜上获得了特异性扩增产物，占总数的68.2％。利用多态性EST-SSR标记分别对黄瓜和甜瓜材料的系统发生关系进行了评价。20个黄瓜EST-SSR在12份黄瓜种质上检测到的PIC值为0.153～0.733，平均PIC值为0.446。12份种质两两之间的Jaccard相似系数范围为0.142～0.935。利用UPGMA法进行系统聚类分析，可以将12份种质显著地分为欧洲种质和我国种质（Bootstrap值大于99％），主坐标分析还可以将我国黄瓜种质进一步细分为绿皮黄瓜种质和白皮黄瓜种质。在甜瓜上，22个EST-SSR在27份甜瓜种质上检测到的PIC值范围为0.168～0.679，平均PIC值为0.433。27份甜瓜种质两两之间的Jaccard相似系数范围为0.393～0.946，基于UPGMA法的系统聚类分析和主坐标分析都能十分明显区分出薄皮甜瓜种质和厚皮甜瓜种质。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 随机DNA标记
• 1.2.1.1 RFLP
• 1.2.1.2 RAPD
• 1.2.1.3 AFLP
• 1.2.1.4 ISSR
• 1.2.1.5 SSR
• 1.2.2 基因靶向标记
• 1.2.2.1 cDNA-RFLP
• 1.2.2.2 cDNA-AFLP
• 1.2.2.3 EST-SSR
• 1.2.2.4 EST-SNP
• 1.2.2.5 ESTP
• 1.2.2.6 Indel
• 1.2.2.7 COS
• 1.2.2.8 ACGM
• 1.2.2.9 GST
• 1.2.3 功能标记
• 1.3 研究的目的和内容
• 2. 材料与方法
• 2.1 Cucumis属EST和基因序列的获得
• 2.2 EST和基因序列的组装
• 2.3 EST-SSR位点的搜寻
• 2.4 Unigene上ORF的确定
• 2.5 EST-SSR引物设计
• 2.6 EST-SSR功能注释
• 2.7 EST-SSR多态性评价
• 2.7.1 植物材料
• 2.7.2 DNA的提取
• 2.7.3 PCR扩增
• 2.7.4 电泳检测
• 2.8 数据处理
• 2.8.1 EST-SSR的特征参数
• 2.8.2 EST-SSR用于系统发生关系的分析
• 2.8.2.1 多态性信息含量
• 2.8.2.2 聚类分析
• 2.8.2.3 聚类分析的非参数检验
• 2.8.2.4 主坐标分析
• 3 结果与分析
• 3.1 Cucumis属EST-SSR的鉴定
• 3.1.1 EST序列的获得和组装
• 3.1.2 EST-SSR的发生频率
• 3.1.3 EST-SSR重复基序长度分布
• 3.1.4 EST-SSR不同重复基序类型的分布
• 3.1.5 EST-SSR位点序列长度的分布
• 3.1.6 EST-SSR基序重复次数的分布
• 3.1.7 SSR在Unigene上的分布
• 3.1.8 不同长度的重复基序在Unigene上的分布
• 3.2 EST-SSR标记的开发
• 3.2.1 EST-SSR引物设计
• 3.2.2 EST-SSR多态性评价
• 3.2.2.1 无扩增产物的引物对
• 3.2.2.2 非特异性扩增的引物对
• 3.2.2.3 有特异性扩增产物但无多态性的引物对
• 3.2.2.4 具有多态性的EST-SSR引物对
• 3.2.3 EST-SSR标记的功能注释
• 3.3 EST-SSR标记在种质系统发生关系研究中的应用
• 3.3.1 EST-SSR标记的多态性信息含量（PIC）
• 3.3.2 EST-SSR标记对黄瓜系统发生关系的评价
• 3.3.2.1 黄瓜种质的聚类分析
• 3.3.2.2 黄瓜种质的主坐标分析
• 3.3.3 EST-SSR标记对甜瓜种质系统发生关系的评价
• 3.3.3.1 甜瓜种质的聚类分析
• 3.3.3.2 甜瓜种质的主坐标分析
• 4 讨论
• 4.1 SSR在基因组上的分布特征及进化机制
• 4.1.1 SSR的分布特征
• 4.1.2 移码突变的选择压力
• 4.1.3 SSR位点的长度与突变方向
• 4.1.4 SSR的功能
• 4.2 EST序列数据库的利用
• 4.3 Cucumis属EST-SSR标记和基因组SSR标记的比较
• 4.3.1 SSR的类型和发生频率
• 4.3.2 SSR的多态性比率
• 4.3.3 SSR的多态性
• 4.3.4 SSR的可转移性
• 4.4 Cucumis属EST-SSR标记同其它分子标记的比较
• 5 主要结论
• 参考文献
• 附录
• 附录1 CTAB法提取基因组DNA
• 附录2 变性胶的制备及电泳
• 附录3 变性胶银染染色
• 附录4 8%非变性PAGE胶制备及染色
• 附录5 论文发表
• 致谢