贵州竹乡乌骨鸡Ghrelin基因的克隆、表达及生理活性的研究

论文摘要

Ghrelin是生长素促泌物受体（growth hormone secretagague receptor,GHS-R）的内源性配体,是目前为止除了生长激素释放激素和生长抑素外,第三个调节GH分泌的内源性物质。哺乳类的Ghrelin促进生长激素的释放,提高动物的食欲;特别在能量平衡等生理过程中起重要的调节作用,成为近年来备受关注的脑肠肽。目前关于Ghrelin在禽类方面的研究较少,贵州竹乡乌骨鸡Ghrelin与其生长和摄食调控等之间的关系还不清楚。本研究应用PCR、RT-PCR等技术对Ghrelin基因的结构、原核表达及生理活性进行了研究。在克隆了Ghrelin基因和cDNA的基础上,成功构建了Ghrelin的原核表达质粒,获得原核表达菌株ER2566/PTYB11/G,经优化,该菌株在37℃,OD600=0.5,诱导5小时的表达量最高,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%,经亲和层析纯化了融合蛋白。以纯化的融合蛋白和人工合成的Ghrelin-KLH为抗原,制备了鸡、兔抗血清:通过主动免疫、被动免疫中和实验证实禽类Ghrelin对鸡血浆中代谢产物、胰岛素、胰高血糖素、甲状腺素浓度没有明显的影响,对GH的分泌有促进作用,但与哺乳动物中不同,Ghrelin抑制鸡的脂重、体重的增加,抑制鸡的摄食。本文的研究为贵州竹乡乌骨鸡的规模化养殖奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 一 前言
• 1. Ghrelin的分子结构
• 2. Ghrelin的分布和定位
• 3. Ghrelin的分泌与调节
• 4. 生长激素促分泌剂及其受体
• 5. Ghrelin受体的分布与定位
• 6. Ghrelin的作用机制
• 7. Ghrelin的生物学功能
• 7.1 对内分泌系统的影响
• 7.2 对摄食和能量代谢的影响
• 7.3 对胰腺内分泌及外分泌的影响
• 7.4 对消化系统的影响
• 7.5 对心血管系统的影响
• 7.6 其它生物学功能
• 8. 展望
• 9. 本论文的研究目的和意义
• 二 材料与方法
• 1. 实验动物
• 2. 载体、菌株及主要生化试剂
• 3. 实验仪器
• 4. 培养基
• 5. 试剂的配制
• 6. 试验方法
• 6.1 乌骨鸡胃部组织基因组及总RNA的提取
• 6.2 Ghrelin DNA的扩增
• 6.3 DNA的回收
• 6.4 DNA连接
• 6.5 感受态细胞的制备
• 6.6 DNA的转化
• 6.7 菌落PCR
• 6.8 重组质粒的提取
• 6.9 质粒PCR
• 6.10 DNA的酶切
• 6.11 测序
• 6.12 Ghrelin cDNA的合成
• 6.13 乌骨鸡Ghrelin cDNA的扩增
• 6.14 cDNA的回收
• 6.15 cDNA的连接转化与鉴定
• 6.16 乌骨鸡Ghrelin编码片段的扩增
• 6.17 Ghrelin编码片段及表达载体的酶切
• 6.18 Ghrelin编码片段的连接
• 6.19 Ghrelin编码片段的转化及鉴定
• 6.20 原核表达质粒的诱导表达
• 6.21 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 6.22 Western bolt分析
• 6.23 表达产物的大量制备及纯化
• 6.24 抗原的制备
• 6.25 抗血清的制备
• 6.26 抗血清效价的测定
• 6.27 实验动物的分组及处理
• 6.28 实验动物的饲养
• 6.29 检测指标及测定方法
• 三 结果
• 1. 贵州竹乡乌骨鸡Ghrelin DNA的克隆
• 2. 贵州竹乡乌骨鸡Ghrelin cDNA的克隆
• 3. 贵州竹乡乌骨鸡Ghrelin基因的原核表达
• 3.1 贵州竹乡乌骨鸡Ghrelin表达重组质粒的构建
• 3.2 贵州竹乡乌骨鸡Ghrelin重组质粒的诱导表达
• 3.3 贵州竹乡乌骨鸡Ghrelin重组质粒融合蛋白表达条件的优化
• 4. 融合蛋白的纯化
• 5. Westen blot检测
• 6. 抗原的制备
• 7. 抗血清的制备
• 7.1 兔抗Ghrelin-KLH抗血清的制备
• 7.2 鸡抗Ghrelin-KLH/融合蛋白抗血清的制备
• 8. 贵州竹乡乌骨鸡Ghrelin生理活性研究
• 8.1 Ghrelin对鸡体重的影响
• 8.2 Ghrelin对脂肪沉积及部份器官的影响
• 8.3 Ghrelin对鸡摄食量的影响
• 8.4 Ghrelin对鸡血浆T4、T3、GH、胰岛素、胰高血糖素、Ghrelin的影响
• 8.5 Ghrelin对鸡血浆TP、ALb、CHO、TG、GLU、UA的影响
• 四 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢