论文摘要
目的：构建全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库，从抗体库中筛选抗鼻咽癌的噬菌体单链抗体（ScFv），并对其进行鉴定和测序分析。方法：体外致敏并用EBV转化鼻咽癌患者的PBMC。用PCR分别扩增VH和VL基因并组成ScFv基因。将ScFv基因与载体fuse5连接后，电击转化大肠杆菌MC1061，构建噬菌体呈现型ScFv库。用人鼻咽癌细胞系CNE2及人胚肺成纤维细胞系HFF对初级噬菌体抗体库进行亲和富集phage-ELISA筛选。筛选获得的阳性克隆进行ELISA及免疫组化鉴定并测序。结果：经EBV转化的3例鼻咽癌患者PBMC，ELISA检测均有抗鼻咽癌抗体产生，经多次PCR，扩增出6种VH（γ、μ）和9种VL（κ、λ）基因，经连接组成54种ScFv基因。将ScFv基因与载体连接后，导入大肠杆菌MC1061。经四环素抗性筛选，得到库容量为6.5×107的初级噬菌体抗体库，噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为100％。用人鼻咽癌细胞系CNE2和人胚肺成纤维细胞系HFF对抗体库进行三轮正负淘选和富集后，从中随机挑取828个克隆进行ELISA筛选，得到245个阳性克隆，阳性率为29.6％。将245个阳性克隆进一步进行其他细胞系的ELISA鉴定，发现克隆F20与三株鼻咽癌细胞系CNE2、HNE2和CNE1均呈阳性反应，而与人胚肺成纤维细胞系HFF、骨髓间质干细胞系HBMSC、原代培养的脐静脉内皮细胞HUVEC及其他人肿瘤细胞系反应呈弱阳性或不反应。免疫细胞化学结果与细胞ELISA结果基本一致；免疫组织化学结果显示：与10例人鼻咽癌组织呈不同程度阳性反应，反应部位主要见于胞膜、胞浆，而与5例正常鼻黏膜组织均无阳性反应。对克隆F20进行测序分析，结果表明：克隆F20的重链可变区基因与人胚系IgVH3-23有92.8％的同源性，轻链可变区基因与人胚系IgV4-2有94.2％的同源性；V-D-J分别属于VH3-23-D6-6-JH6-linker-V4-2-JL2。结论：应用体外抗原致敏方法和EBV转化技术联合噬菌体抗体库技术，构建库容量达6.5×107的全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库。通过ELISA、免疫细胞化学和免疫组织化学鉴定，获得的噬菌体抗体克隆F20具有较强的特异性，为鼻咽癌的早期诊断及导向治疗奠定了基础。