论文摘要
植物内生菌作为筛选农用抗生素的一类资源微生物，在农药的研究与开发中越来越受到重视。为了开发卫矛科植物内生菌资源，以期发现新的具有农药研究价值的微生物，本论文对4种卫矛科植物内生菌进行了研究，主要涉及菌种的分离、筛选、菌株鉴定、菌株诱变选育、代谢产物活性及活性成分分离以及发酵条件优化等的研究，取得了如下结果：（1）分别采用组织块培养法和匀浆法从4种新鲜卫矛科植物中分离到161株内生真菌和28株内生放线菌，通过杀虫活性、抑菌活性及遗传稳定性实验，从中筛选到能产生抑菌活性成分的内生真菌3株（Hd3、2QR1和1F8）和内生放线菌4株（a4、a5、c4和YDG17）。其中，菌株Hd3和2QR1的代谢产物也具有杀虫活性。（2）利用引入链霉素耐药性，分别对5株无抑菌活性和1株弱抑菌活性的卫矛科植物内生放线菌进行诱突，共获得链霉素变异株301株。对301株变异菌株发酵产物以枯草芽孢杆菌为指示菌进行活性筛选，获得具有显著抑菌活性且遗传稳定的突变株2株，即YDG05-44和YDG09-32。室内生物测定结果表明，YDG05-44和YDG09-32菌株的发酵产物对其它几种细菌及植物病原真菌也具有显著的抑菌活性。（3）对YDG17、YDG09-32和Hd3菌株的发酵条件进行了优化研究，确定了最佳培养基组成及培养条件。响应面分析及正交实验结果表明，YDG17菌株发酵的摇瓶培养基配方为：葡萄糖32．00 g／L，小米28．77 g／L，蛋白胨3．00 g／L。发酵条件为：pH 7，250mL三角瓶装60mL发酵液，接入6×107cfu／mL菌量，32℃培养120h。YDG09-32菌株发酵的摇瓶培养基配方为：乳糖21．06 g／L，小米20．82 g／L，牛肉膏4．72 g／L，MgSO4·7H2O 0．38g／L。发酵条件为：pH 7～9，250mL三角瓶装80mL发酵液，接入6×106cfu／mL菌量，29℃培养96h。Hd3菌株的摇瓶培养基配方为：葡萄糖24．71g／L，MgSO4·7H2O 1．08 g／L，土豆244．17 g／L。发酵条件为：pH 6～7，250mL三角瓶装90mL发酵液，接入9×103cfu／mL菌量，31℃培养9d。（4）研究了YDG17菌株的代谢产物。室内生测结果表明，YDG17菌株的发酵液对几种供试细菌和病原真菌均有一定的抑制作用。对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtills）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichis coli）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）的抑菌圈直径分别为27．0，27．0，15．3，11．3，14．0mm。对小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、西瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporum f．sp．niveum）和桃腐烂病菌（Cytospora leucostoma）抑制菌丝生长的EC50（以发酵液中的干物质计）值分别为259．98、336．13、100．72、470．11和198．58mg／L；对小麦赤霉病菌（F．graminearum）、西瓜枯萎病菌（F．oxysporum f．sp．niveum）和番茄灰霉病菌（B．cinerea）抑制孢子萌发的EC50值为分别为151．67、220．69和87．84mg／L。离体子叶法测定结果表明，发酵液原液对番茄灰霉病的保护效果为97．62％，治疗效果为79．63％。盆栽试验结果表明，发酵液原液对番茄灰霉病的保护效果为71．34％，治疗效果为64．23％。通过捷克八溶剂系统纸色谱测定YDG17菌株发酵液中主要活性成分为碱性水溶性抗生素。采用离子交换法，通过抑菌活性追踪法，分离得到YDG17菌株发酵液的主要抑菌活性组分YA，ESI-MS／MS对YA化学成分进行分析，结果表明YA中的主要活性成分为链丝菌素类化合物，通过MS／MS谱图和母离子碎片峰信息，以及与标准化合物谱图进行对比，鉴定其中5个化合物为N-乙酰化链丝菌素D、N-乙酰化链丝菌素C、链丝菌素D、链里定酸-链丝菌素E和链丝菌素F。（5）研究了YDG09-32菌株的代谢产物。离体活性测定结果表明，YDG09-32菌株的发酵滤液和菌丝体中均有含有抑菌活性成分，不仅对供试细菌有一定的抑制作用，同时对小麦赤霉病菌（F．graminearum）、玉米弯孢菌（Curvularia lunta）、番茄灰霉病菌（B．cinerea）和苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）等植物病原真菌有较强的抑制活性。通过Doskocilova八溶剂系统分析，判断YDGA09-32菌株发酵滤液和菌丝体提取物中的抑菌活性成分为同一类物质，即放线菌素类抗生素。YDG09-32菌株代谢的抑菌活性成分对光、热、酸和碱均有较好的稳定性。发酵产物在pH 5～11之间处理3h，或在90℃处理30min以及日光照射10d后，对抑菌活性均无明显影响。采用大孔吸附树脂吸附、硅胶柱层析及薄层制备等技术对YDG093-32菌株发酵滤液中抑菌成分进行分离纯化，得到Bh1～Bh7 7个组分，生测结果表明，仅组分Bh1、Bh5和Bh6对枯草芽孢杆菌具有较好的抑菌活性。Bh1～Bh7组分由于纯度不够，未能进行结构鉴定。（6）研究了Hd3菌株的代谢产物。分别对Hd3菌株菌丝体甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取物及发酵滤液乙酸乙酯萃提物进行了杀虫、抑菌活性研究。结果表明，Hd3菌株的杀虫活性物质主要存在于菌丝体乙酸乙酯提取物中，在1000mg／L时，对粘虫3龄幼虫的24h死亡率为100％；抑菌活性物质主要在发酵液中，其乙酸乙酯萃取物对小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、苹果炭疽病菌（C．gloeosporioides）、小麦赤霉病菌（F．graminearum）、番茄灰霉病菌（B．cinerea）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f．sp．vasinfectum）和玉米弯孢菌（C．lunta）抑制菌丝生长的EC50值分别为77．7，74．9、75．6、138．3、166．0和130．9 mg／L，对棉花枯萎病菌（F．oxysporumf．sp．vasinfectum）、番茄灰霉病菌（B．cinerea）、小麦根腐病菌（B．sorokiniana）和玉米弯孢菌（C．lunta）抑制孢子萌发EC50值分别为184．4，102．8，154．5和79．7mg／L；盆栽试验结果表明，Hd3菌株发酵滤液乙酸乙酯萃取物在浓度为2000mg／L时，对小麦白粉病的保护和治疗效果分别为61．9％和81．6％。对Hd3菌株菌丝体乙酸乙酯提取物中的杀虫活性成分进行分离，得到一个纯化合物H4．5，经波谱分析，鉴定为2，3-二甲氧基-5-甲基苯酚，该化合物对3龄粘虫（平均体重3．75mg）的LD50为3．78μg／头。通过活性追踪，采用硅胶柱层析、HPLC制备对菌株发酵滤液乙酸乙酯萃提物中抑菌活性成分进行分离，得到H03～H09，H20 8个化合物，生测结果表明，化合物H03、H04、H20具有较强的抑菌活性。经波谱分析，化合物H03、H04、H05、H07、H08和H20分别鉴定为geodin、chlorotrypacidin、methyl asterrate、methyl dichloroasterrate、methyl chloroasterrate和asterric acid，均为首次从内生黄柄曲霉代谢物中分离到的化合物。（7）通过对YDG17、YDG09和Hd3菌株形态学及分子生物学鉴定，确定Hd3菌株为曲霉属真菌：YDG09和YDG17菌株均为链霉菌属放线菌。YDG17菌株与菌株S．vinaceusdrappuss的16SrDNA同源性为99％，同时，菌株在形态特征、培养特征、生理生化特征等方面与模式菌株也比较相似。因此，将YDG17菌株鉴定为Streptomyces vinaceusdrappuss。YDG09菌株与模式菌株S．rubrolavendulae的16SrDNA同源性为99％。除了YDG09菌株不利用阿拉伯糖、甘露醇而利用鼠李糖及在克氏一号培养基上难于生长与S．rubrolavendulae菌株存在差异外，在生理生化及形态特征上两株菌均相似。因此，建议将YDG09菌株定为S．rubrolavendulae菌株的一个变种（Streptomycesrubrola vendulae var euonymus）。Hd3菌株与模式菌株Aspergillus flavipes的ITS区序列同源性为100％，在形态特征等方面两株菌也相似，因此，鉴定Hd3菌株为黄柄曲霉Aspergillus flavipes。