卫矛科植物内生菌的分离及其农药生物活性研究

卫矛科植物内生菌的分离及其农药生物活性研究

论文摘要

植物内生菌作为筛选农用抗生素的一类资源微生物,在农药的研究与开发中越来越受到重视。为了开发卫矛科植物内生菌资源,以期发现新的具有农药研究价值的微生物,本论文对4种卫矛科植物内生菌进行了研究,主要涉及菌种的分离、筛选、菌株鉴定、菌株诱变选育、代谢产物活性及活性成分分离以及发酵条件优化等的研究,取得了如下结果:(1)分别采用组织块培养法和匀浆法从4种新鲜卫矛科植物中分离到161株内生真菌和28株内生放线菌,通过杀虫活性、抑菌活性及遗传稳定性实验,从中筛选到能产生抑菌活性成分的内生真菌3株(Hd3、2QR1和1F8)和内生放线菌4株(a4、a5、c4和YDG17)。其中,菌株Hd3和2QR1的代谢产物也具有杀虫活性。(2)利用引入链霉素耐药性,分别对5株无抑菌活性和1株弱抑菌活性的卫矛科植物内生放线菌进行诱突,共获得链霉素变异株301株。对301株变异菌株发酵产物以枯草芽孢杆菌为指示菌进行活性筛选,获得具有显著抑菌活性且遗传稳定的突变株2株,即YDG05-44和YDG09-32。室内生物测定结果表明,YDG05-44和YDG09-32菌株的发酵产物对其它几种细菌及植物病原真菌也具有显著的抑菌活性。(3)对YDG17、YDG09-32和Hd3菌株的发酵条件进行了优化研究,确定了最佳培养基组成及培养条件。响应面分析及正交实验结果表明,YDG17菌株发酵的摇瓶培养基配方为:葡萄糖32.00 g/L,小米28.77 g/L,蛋白胨3.00 g/L。发酵条件为:pH 7,250mL三角瓶装60mL发酵液,接入6×107cfu/mL菌量,32℃培养120h。YDG09-32菌株发酵的摇瓶培养基配方为:乳糖21.06 g/L,小米20.82 g/L,牛肉膏4.72 g/L,MgSO4·7H2O 0.38g/L。发酵条件为:pH 7~9,250mL三角瓶装80mL发酵液,接入6×106cfu/mL菌量,29℃培养96h。Hd3菌株的摇瓶培养基配方为:葡萄糖24.71g/L,MgSO4·7H2O 1.08 g/L,土豆244.17 g/L。发酵条件为:pH 6~7,250mL三角瓶装90mL发酵液,接入9×103cfu/mL菌量,31℃培养9d。(4)研究了YDG17菌株的代谢产物。室内生测结果表明,YDG17菌株的发酵液对几种供试细菌和病原真菌均有一定的抑制作用。对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichis coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的抑菌圈直径分别为27.0,27.0,15.3,11.3,14.0mm。对小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.niveum)和桃腐烂病菌(Cytospora leucostoma)抑制菌丝生长的EC50(以发酵液中的干物质计)值分别为259.98、336.13、100.72、470.11和198.58mg/L;对小麦赤霉病菌(F.graminearum)、西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)和番茄灰霉病菌(B.cinerea)抑制孢子萌发的EC50值为分别为151.67、220.69和87.84mg/L。离体子叶法测定结果表明,发酵液原液对番茄灰霉病的保护效果为97.62%,治疗效果为79.63%。盆栽试验结果表明,发酵液原液对番茄灰霉病的保护效果为71.34%,治疗效果为64.23%。通过捷克八溶剂系统纸色谱测定YDG17菌株发酵液中主要活性成分为碱性水溶性抗生素。采用离子交换法,通过抑菌活性追踪法,分离得到YDG17菌株发酵液的主要抑菌活性组分YA,ESI-MS/MS对YA化学成分进行分析,结果表明YA中的主要活性成分为链丝菌素类化合物,通过MS/MS谱图和母离子碎片峰信息,以及与标准化合物谱图进行对比,鉴定其中5个化合物为N-乙酰化链丝菌素D、N-乙酰化链丝菌素C、链丝菌素D、链里定酸-链丝菌素E和链丝菌素F。(5)研究了YDG09-32菌株的代谢产物。离体活性测定结果表明,YDG09-32菌株的发酵滤液和菌丝体中均有含有抑菌活性成分,不仅对供试细菌有一定的抑制作用,同时对小麦赤霉病菌(F.graminearum)、玉米弯孢菌(Curvularia lunta)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)和苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)等植物病原真菌有较强的抑制活性。通过Doskocilova八溶剂系统分析,判断YDGA09-32菌株发酵滤液和菌丝体提取物中的抑菌活性成分为同一类物质,即放线菌素类抗生素。YDG09-32菌株代谢的抑菌活性成分对光、热、酸和碱均有较好的稳定性。发酵产物在pH 5~11之间处理3h,或在90℃处理30min以及日光照射10d后,对抑菌活性均无明显影响。采用大孔吸附树脂吸附、硅胶柱层析及薄层制备等技术对YDG093-32菌株发酵滤液中抑菌成分进行分离纯化,得到Bh1~Bh7 7个组分,生测结果表明,仅组分Bh1、Bh5和Bh6对枯草芽孢杆菌具有较好的抑菌活性。Bh1~Bh7组分由于纯度不够,未能进行结构鉴定。(6)研究了Hd3菌株的代谢产物。分别对Hd3菌株菌丝体甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取物及发酵滤液乙酸乙酯萃提物进行了杀虫、抑菌活性研究。结果表明,Hd3菌株的杀虫活性物质主要存在于菌丝体乙酸乙酯提取物中,在1000mg/L时,对粘虫3龄幼虫的24h死亡率为100%;抑菌活性物质主要在发酵液中,其乙酸乙酯萃取物对小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、苹果炭疽病菌(C.gloeosporioides)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)和玉米弯孢菌(C.lunta)抑制菌丝生长的EC50值分别为77.7,74.9、75.6、138.3、166.0和130.9 mg/L,对棉花枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.vasinfectum)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、小麦根腐病菌(B.sorokiniana)和玉米弯孢菌(C.lunta)抑制孢子萌发EC50值分别为184.4,102.8,154.5和79.7mg/L;盆栽试验结果表明,Hd3菌株发酵滤液乙酸乙酯萃取物在浓度为2000mg/L时,对小麦白粉病的保护和治疗效果分别为61.9%和81.6%。对Hd3菌株菌丝体乙酸乙酯提取物中的杀虫活性成分进行分离,得到一个纯化合物H4.5,经波谱分析,鉴定为2,3-二甲氧基-5-甲基苯酚,该化合物对3龄粘虫(平均体重3.75mg)的LD50为3.78μg/头。通过活性追踪,采用硅胶柱层析、HPLC制备对菌株发酵滤液乙酸乙酯萃提物中抑菌活性成分进行分离,得到H03~H09,H20 8个化合物,生测结果表明,化合物H03、H04、H20具有较强的抑菌活性。经波谱分析,化合物H03、H04、H05、H07、H08和H20分别鉴定为geodin、chlorotrypacidin、methyl asterrate、methyl dichloroasterrate、methyl chloroasterrate和asterric acid,均为首次从内生黄柄曲霉代谢物中分离到的化合物。(7)通过对YDG17、YDG09和Hd3菌株形态学及分子生物学鉴定,确定Hd3菌株为曲霉属真菌:YDG09和YDG17菌株均为链霉菌属放线菌。YDG17菌株与菌株S.vinaceusdrappuss的16SrDNA同源性为99%,同时,菌株在形态特征、培养特征、生理生化特征等方面与模式菌株也比较相似。因此,将YDG17菌株鉴定为Streptomyces vinaceusdrappuss。YDG09菌株与模式菌株S.rubrolavendulae的16SrDNA同源性为99%。除了YDG09菌株不利用阿拉伯糖、甘露醇而利用鼠李糖及在克氏一号培养基上难于生长与S.rubrolavendulae菌株存在差异外,在生理生化及形态特征上两株菌均相似。因此,建议将YDG09菌株定为S.rubrolavendulae菌株的一个变种(Streptomycesrubrola vendulae var euonymus)。Hd3菌株与模式菌株Aspergillus flavipes的ITS区序列同源性为100%,在形态特征等方面两株菌也相似,因此,鉴定Hd3菌株为黄柄曲霉Aspergillus flavipes。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 植物内生菌研究概况
  • 1.1.1 植物内生菌的定义及其异质性
  • 1.1.2 内生菌的研究简史
  • 1.1.3 植物内生菌的普遍存在性和生物多样性
  • 1.1.4 内生菌的潜在应用价值
  • 1.2 植物内生菌活性代谢产物研究进展
  • 1.2.1 抗菌活性物质
  • 1.2.2 抗肿瘤活性物质
  • 1.2.3 杀虫活性物质
  • 1.2.4 植物激素类物质
  • 1.2.5 其它活性物质
  • 1.3 卫矛科植物及内生菌研究概况
  • 1.4 产农用抗生素内生菌研究中存在的问题及策略
  • 1.5 立题依据及研究内容
  • 1.6 拟采用的技术路线
  • 第二章 4种卫矛科植物内生菌的分离及活性菌株筛选
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 植物材料
  • 2.1.2 主要试剂与仪器
  • 2.1.3 培养基
  • 2.1.4 供试昆虫
  • 2.1.5 供试真菌及细菌
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 植物材料的表面消毒
  • 2.2.2 内生菌的分离培养
  • 2.2.3 菌株的纯化和归类
  • 2.2.4 内生菌的液体培养
  • 2.2.5 生物活性测定样品准备
  • 2.2.6 内生菌代谢产物生物活性测定
  • 2.3 结果与分析
  • 2.3.1 表面消毒效果
  • 2.3.2 内生菌分离结果
  • 2.3.3 内生菌代谢产物生物活性测定
  • 2.3.4 能代谢活性产物内生菌形态归类及遗传稳定性测定
  • 2.4 小结
  • 第三章 利用链霉素耐药性诱变筛选抑菌活性菌株
  • 3.1 试验材料
  • 3.1.1 供试菌株
  • 3.1.2 培养基
  • 3.1.3 仪器及试剂
  • 3.2 试验方法
  • 3.2.1 突变菌株获得
  • 3.2.2 变异菌株的发酵培养
  • 3.2.3 变异菌株活性筛选
  • 3.2.4 变异菌株遗传稳定性的测定
  • 3.2.5 遗传稳定抗性菌株杀菌活性测定
  • 3.3 结果与分析
  • 3.3.1 供试菌株对链霉素的MIC及链霉素耐药性菌株的获得
  • 3.3.2 链霉素耐药性变异菌株活性筛选结果
  • 3.3.3 链霉素变异菌株YDG05-44,YDG09-11,YDG09-28,YDG09-32和YDG09-34发酵液杀菌活性的传代稳定性
  • 3.3.4 链霉素耐药性变异菌株YDG05-44和YDG09-32及其原始菌株发酵液抑菌活性比较
  • 3.3.5 耐药性变异菌株YDG05-44和YDG09-32及其出发菌株形态比较
  • 3.4 小结与讨论
  • 第四章 YDG17、YDG09-32和HD3菌株发酵条件优化
  • 4.1 实验材料
  • 4.1.1 实验菌株
  • 4.1.2 生测菌株
  • 4.1.3 试剂及原料
  • 4.1.4 培养基
  • 4.2 方法
  • 4.2.1 平板培养
  • 4.2.2 摇瓶发酵
  • 4.2.3 发酵产物活性评估
  • 4.2.4 发酵培养基优化实验设计及分析
  • 4.2.5 初始pH值影响测定
  • 4.2.6 发酵条件优化试验
  • 4.3 结果与分析
  • 4.3.1 发酵培养基配方的初步选择
  • 4.3.2 YDG17发酵培养基配方筛选结果
  • 4.3.3 YDG09-32菌株发酵培养基配方筛选结果
  • 4.3.4 Hd3菌株发酵培养基配方筛选结果
  • 4.3.5 发酵条件优化
  • 4.4 小结及讨论
  • 第五章 YDG17菌株发酵液抑菌活性及活性成分研究
  • 5.1 实验材料
  • 5.1.1 供试菌株
  • 5.1.2 培养基
  • 5.1.3 供试生物
  • 5.1.4 主要试剂与仪器
  • 5.2 试验方法
  • 5.2.1 液体培养及产物处理
  • 5.2.2 抑菌活性测定
  • 5.2.3 YDG17菌株发酵液中抑菌活性成分分离
  • 5.3 结果与分析
  • 5.3.1 YDG17菌株发酵液的抑菌活性
  • 5.3.2 YDG17菌株发酵滤液中抑菌活性成分分离
  • 5.3.3 YDG17菌株发酵滤液活性馏分YA中化合物的结构鉴定
  • 5.4 小结及讨论
  • 5.4.1 YDG17菌株发酵液抑菌生物活性
  • 5.4.2 YDG17菌株发酵液中抑菌活性成分分离及结构鉴定
  • 第六章 YDG09-32菌株发酵产物的抑菌活性及活性成分研究
  • 6.1 实验材料
  • 6.1.1 供试菌株
  • 6.1.2 培养基
  • 6.1.3 供试菌
  • 6.1.4 主要试剂与仪器
  • 6.2 试验方法
  • 6.2.1 液体培养及产物处理
  • 6.2.2 抑菌活性测定
  • 6.2.3 YDG09-32菌株抑菌活性成分的初步定性
  • 6.2.4 YDG09-32菌株发酵液抑菌活性成分稳定性测定
  • 6.2.5 菌株发酵液中抑菌活性物质分离纯化
  • 6.3 结果与分析
  • 6.3.1 YDG09-32菌株发酵产物抑菌活性测定
  • 6.3.2 YDG09-32菌株发酵产物抑菌活性物质的初步定性
  • 6.3.3 YDG09-32菌株发酵产物中活性成分稳定性测定
  • 6.3.4 大孔吸附树脂分离
  • 6.3.5 一级柱层析分离
  • 6.3.6 二级柱层析分离
  • 6.3.7 Pre-TLC分离
  • 6.4 小结与讨论
  • 6.4.1 关于YDG09-32菌株发酵产物活性物质的分离
  • 6.4.2 关于发酵液中抗生素粗提物的获得
  • 6.4.3 关于YDG09-32产生抗生素的潜在应用价值
  • 第七章 HD3菌株代谢产物的杀虫抗菌活性研究
  • 7.1 实验材料
  • 7.1.1 供试菌株
  • 7.1.2 培养基
  • 7.1.3 供试昆虫
  • 7.1.4 供试病原菌
  • 7.1.5 供试植物
  • 7.1.6 主要试剂与仪器
  • 7.2 试验方法
  • 7.2.1 液体培养
  • 7.2.2 发酵产物活性成分的提取
  • 7.2.3 杀虫活性测定
  • 7.2.4 抑菌离体活性测定
  • 7.2.5 小麦白粉盆栽试验
  • 7.2.6 Hd3菌株菌丝体乙酸乙酯提取物杀虫活性成分的分离
  • 7.2.7 Hd3菌株发酵液乙酸乙酯萃取物杀菌活性成分的分离
  • 7.2.8 化合物的结构鉴定
  • 7.3 结果与分析
  • 7.3.1 Hd3菌株代谢产物的杀虫活性
  • 7.3.2 Hd3菌株代谢产物的离体杀菌活性
  • 7.3.3 Hd3菌株菌丝体乙酸乙酯提取物杀虫活性分离结果
  • 7.3.4 Hd3菌株发酵液乙酸乙酯萃取物抑菌成分分离结果
  • 7.3.5 化合物的结构鉴定
  • 7.3.6 化合物生物活性测定
  • 7.4 小结及讨论
  • 7.4.1 Hd3菌株代谢产物的生物活性
  • 7.4.2 Hd3菌株代谢产物活性成分分离
  • 7.4.3 关于化合物2,3-二甲氧基-5-甲基苯酚
  • 7.4.4 关于asterric acid类化合物
  • 第八章 菌种鉴定
  • 8.1 试验材料
  • 8.1.1 供试菌株
  • 8.1.2 试剂
  • 8.1.3 仪器
  • 8.1.4 培养基
  • 8.2 试验方法
  • 8.2.1 形态特征观察
  • 8.2.2 培养特征观察
  • 8.2.3 YDG17和YDG09菌株生理生化特征性测定
  • 8.2.4 YDG17和YDG09菌株细胞壁的化学成分分析
  • 8.2.5 分子鉴定
  • 8.3 结果与分析
  • 8.3.1 形态特征
  • 8.3.2 培养特征
  • 8.3.3 生理生化特征
  • 8.3.4 细胞壁化学成分分析
  • 8.3.5 分子鉴定
  • 8.4 小结及讨论
  • 8.4.1 关于内生放线菌菌株YDG09和YDG17种属地位的确定
  • 8.4.2 真菌ITS区序列结构应用及内生真菌菌株Hd3种属地位的确定
  • 论文总结
  • 论文的创新点
  • 参考文献
  • 附图
  • 致谢
  • 作者简介
  • 相关论文文献

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