论文摘要
目的：细胞因子是指由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称，研究发现HBV慢性肝病的发生、发展及其演变与细胞因子密切相关。蛋白芯片是继基因芯片后发展起来的一种新的生物检测技术，它的出现对于生物学、临床检验医学、遗传学、肿瘤学和药理学等多学科的进步具有极大的推动作用。目前国内检测细胞因子通常采用酶联免疫吸附试验（ELISA），但ELISA存在着灵敏度较低、重复性较差、分析范围较窄等问题，而具有快速、并行、自动化和高通量的特点蛋白芯片则可以弥补这些缺点。因此参考国内外文献，选取IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、slCAM-1、TGF-β1、TIMP-1等7种细胞因子做为研究靶点，自行构建蛋白芯片，分析蛋白芯片技术与传统的ELISA敏感性和特异性的差别；并借助蛋白芯片技术研究这7种细胞因子在不同类型的HBV慢性肝病中变化规律，寻求能够准确反应肝脏炎症及纤维化程度的新指标；探讨慢性乙型病毒性肝炎、乙肝肝硬化患者不同中医证型与7种细胞因子的相关性，寻求中西医的交融之处，丰富中医“证”的微观指标学说，为慢性肝病中医“证”的客观化和规范化研究奠定基础。方法：将洗净的载玻片放入以1：50丙酮稀释的APES中，停留20～30s，取出后再用纯丙酮溶液冲洗。将7种血清标志物的单克隆抗体用PBS（0.01mol／L，pH7.0）稀释为500mg／L，用Cartisian 5500机器人点样于APES玻片上，每个样品设4个重复。将芯片放于37℃孵育4h，用PBST洗涤3×15s，用封闭液于37℃封闭2h，用PBST洗涤3次×15s，晾干备用。以500mg／L生物素标记的BSA为阳性对照，用无生物素标记的500mg／L BSA为阴性对照。从-80℃冰箱中取出血清样品，置冰盒上溶解后，以5000g，4℃离心5min。取10μl血清，用样本稀释液稀释10倍，400～600r／min冰浴震荡30min。运用点样仪向每个反应孔中加入100山处理好的样品，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，然后加入生物素标记的7种细胞因子的单克隆抗体20μl（浓度为1μg／ml），37℃孵育1h，PBST洗涤3次，再加入Cy3标记的亲和素，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，晾干。将蛋白芯片用Scan Array4000激光共聚焦扫描仪扫描成像，扫描后的图象用Imagene软件分析荧光强度，对所有原始数据根据单个膜阳性与阴性对照值进行标准化处理及减除背景处理，取4个反应孔荧光强度的平均值，通过标准曲线计算与分析结果。将蛋白芯片结果与ELISA检测结果进行比较后，选择慢性乙型病毒性肝炎患者90例，其中轻、中、重度各30例，参照1991年天津会议所制定的《病毒性肝炎中医辨证标准（试行）》进行辨证分型，湿热中阻型20例，肝郁脾虛型26例，瘀血阻络型21例，肝肾阴虛型14例，脾肾阳虛型9例；乙肝肝硬化患者共90例，A、B、C级各30例，中医辨证参考1993年洛阳会议所制定的《肝硬化临床诊断、中医辨证和疗效评定标准（试行方案）》，其中肝气郁结22例，脾虛湿盛18例，湿热内蕴12例，肝肾阴虛7例，脾肾阳虚11例，血瘀证20例；慢性重型乙型病毒性肝炎30例。借助蛋白芯片技术明确7种细胞因子在不同类型HBV慢性肝病的变化规律，并探讨其与中医证型的相关性。结果：（1）成功构建血清细胞因子蛋白芯片，并建立良好的质控标准。预实验中比较了蛋白芯片与ELISA对IL-2、IL-4、TNF-α3种因子的敏感性，结果发现在对34例临床标本的检测中，蛋白芯片及ELISA法均未能检测到IL-2、IL-4，而蛋白芯片却检测到8例慢性乙肝重度患者血清中的TYF-α，ELISA法仅检测出其中的5例。（2）慢性肝病组7种细胞因子与正常对照组均有显著差异（P＜0.05），IL-2、IFN-γ等Th1类细胞因子在慢乙肝轻度中水平基本正常，慢重肝患者浓度最低（P＜0.01）；慢重肝Th2类细胞因子IL-4高达258.56±36.72pg／ml，与其它组有显著差异（P＜0.01），具体变化规律为轻度＜A级＜中度＜重度=B级＜C级＜慢重肝；TNF-α变化规律为轻度=A级＜中度=B级＜C级＜重度＜慢重肝；TGF-β1为轻度＜中度＜重度＜A级＜慢重肝＜B级＜C级；sICAM-1则表现为轻度＜A级＜B级=中度＜重度＜C级=慢重肝；TIMP-1变化规律为轻度＜中度＜A级＜重度＜B级=慢重肝＜C级。（3）与正常组相比，慢性乙肝患者各证型IL-2水平均显著降低（P＜0.05～0.01）；湿热内阻患者IL-4浓度为86.43±19.24 pg／ml，与正常组无差异，其余证型IL-4均显著升高；TNF-α、TGF-β1、sICAM-1及TIMP-1均较正常组显著升高（P＜0.01），湿热内阻证TNF-α浓度为433.58±24.44 pg／ml，上升幅度最大，TGF-β1、sICAM-1及TIMP-1则以瘀血内阻证升高最明显；肝郁脾虚及湿热内阻证患者血清IFN-γ与正常组无差异，而另外3种证型IFN-γ水平均显著低于正常组（P＜0.01）。（4）肝硬化患者除湿热内阻型血清IFN-γ（62.68±8.56 pg／ml）与正常对照组无显著差异外，其余各证型患者血清细胞因子均与正常组有显著差异（P＜0.01）；脾虛湿盛、脾肾阳虚、血瘀证3型IL-2水平显著低于肝气郁结（P＜0.01），而IL-4、TNF-α水平较肝气郁结显著升高（P＜0.01）；TGF-β1、sICAM-1在湿热内阻型中水平最低（P＜0.05～0.01）；TIMP-1则在肝气郁结中浓度167.88±14.21ng／ml，与其它证型有显著差异（P＜0.05～0.01）；湿热内阻证IFN-γ浓度为62.68±8.56pg／ml，与肝气郁结证（58.37±9.75pg／ml）无显著差异，其余证型均低于肝气郁结证（P＜0.01）。结论：蛋白芯片技术检测血清细胞因子较传统的ELISA具有更高的敏感性和可重复性；HBV慢性肝病患者血清细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、sICAM-1、TGF-β1、TIMP-1的水平在一定程度上可反应肝脏炎症及纤维化程度；慢性乙型病毒性肝炎、乙肝肝硬化患者不同中医证型与血清细胞因子有一定相关性，可以将细胞因子纳入HBV慢性肝病患者中医辨证论治的体系中，有利于提高中医辨证的精确性和规范性。