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MICA蛋白在卵巢癌定位诊断的研究

2020-11-22阅读(980)

MICA蛋白在卵巢癌定位诊断的研究

论文摘要

人类MHCⅠ类链相关基因A（MHC classⅠchain-related A,MICA）是Tom Spies等人于1994年发现的、位于人第六号染色体上MHC-Ⅰ类区域的非经典HLA-Ⅰ类基因家族成员,具有高度多态性。MICA蛋白是一种细胞应激分子,研究表明,它在正常组织中表达量很少,仅在肠道上皮组织表达量稍高,但是在多种肿瘤细胞,尤其是上皮源性的肿瘤细胞表面表达量明显上调,可以通过与表达在NK细胞,γδT细胞,CD8+αβT细胞表面的NKG2D受体相结合而被效应细胞识别,介导上述细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。在本实验室的前期工作中,我们已经从卵巢癌细胞系SKOV3中提取总RNA,通过RT-PCR克隆了MICA的全长cDNA。利用pET原核表达系统分别表达了含有MICA胞外结构域α1α2α3的融合蛋白MICAα1-3和胞外结构域α1-α2的融合蛋白MICAα1-2,并制备了抗MICAα1-2的单克隆抗体786、10C6、1287,证明它们均可以与细胞、组织表面的MICA蛋白特异性结合。在上述工作基础上,本研究工作进一步将MICA作为肿瘤相关抗原（tumor associated antigen,TAA）靶向性蛋白,利用其相应的鼠源单克隆抗体作为体内分子探针,研究MICA在临床肿瘤早期诊断和治疗中的应用前景。本论文工作主要研究内容包括三部分:（一） 99mTc标记抗MICA特异性抗体10C6在卵巢癌定位诊断的研究利用ELISA技术测定抗rMICAα1-2单克隆抗体786、10C6、1287的亲和力,从中挑选出亲和力最高的抗体10C6。用直接标记法将99mTc标记到抗体10C6分子上,利用细胞结合实验检测标记后抗体的活性,采用99mTc示踪技术观察标记抗体在荷人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠的体内分布及肿瘤摄取情况,并用γ相机观察全身显像情况,并实时检测标记抗体在小鼠血液和全身的清除速率。此外,还用NBS法将抗体10C6与131I连接,观察标记抗体在荷人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠体内肿瘤的摄取情况,并将两种放射性核素标记的抗体在体内的显像结果作一比较。研究结果提示,MICA可以视为一种新的TAA,作为肿瘤靶向抗原,在肿瘤的早期诊断及治疗中有一定的应用前景。由于99mTc的γ射线能量不高并且射线成份较纯,所以和131I相比,更适合用于肿瘤短期内的显像诊断。（二）高亲和力抗MICA特异性抗体的筛选为筛选到高亲和力抗MICA单克隆抗体,我们重新利用原核表达的重组蛋白rMICAα1-2制备了一系列的特异性抗MICA单克隆抗体。通过ELISA、流式细胞检测技术（flow cytomery,FCM）对抗体进行了筛选及特异性的鉴定。然后通过间接ELISA法,测得6株单抗的相对亲和力,再进一步利用非竞争性ELISA方法测定单克隆抗体7B12的亲和力。高亲和力抗MICAα1-2抗体7B12的获得为进一步的体内诊断定位研究提供了有力的工具。（三） 99mTc标记抗MICA特异性抗体片段7812 Fab’在卵巢癌定位诊断的研究将纯化的抗体7B12用胃蛋白酶酶切纯化后,采用直接标记法将99mTc标记到抗体片段F（ab’）2上,得到99mTc-Fab’。采用99mTc示踪技术观察标记抗体片段在荷人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠的体内分布及肿瘤摄取情况,并用γ相机观察全身显像情况,并实时检测标记抗体在小鼠血液和全身的清除速率。研究结果表明,和以往文献报道相一致,小分子的99mTc-Fab’在体内的血液清除速率明显加快,在肾脏的潴留量大大超过其它脏器。但是本实验中99mTc-Fab’肿瘤的靶向定位效果并不显著,这可能是由于由完整抗体的二价分子变成Fab’一价分子后,抗体效价降低有关,也可能是由于核素偶联制备过程中造成抗体片段亲和力的下降以及7B12抗体本身的特性所造成的。本研究的创新点在于:（1）通过放射性核素标记抗体在荷瘤小鼠体内分布代谢实验及显像实验,证实肿瘤相关抗原MICA蛋白,在肿瘤的早期诊断和治疗中可以作为靶向蛋白;（2）通过体内外实验,证实抗MICA单克隆抗体10C6和7812有一定的临床应用前景。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 英文缩略词表
  • 前言
  • 99mTc标记抗MICA特异性抗体10C6在卵巢癌定位诊断的研究'>第一部分99mTc标记抗MICA特异性抗体10C6在卵巢癌定位诊断的研究
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 四、讨论
  • 第二部分 高亲和力抗MICA单克隆抗体的制备
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、实验结果
  • 四、讨论
  • 99mTc标记抗MICA特异性抗体7812 Fab'在卵巢癌定位诊断的研究'>第三部分99mTc标记抗MICA特异性抗体7812 Fab'在卵巢癌定位诊断的研究
  • 一、实验材料
  • 二、实验方法
  • 三、结果
  • 四、讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 论文综述
  • 附录1
  • 附录2
  • 附录3
  • 个人简历
  • 致谢

    • 相关论文文献

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