东方粘虫颗粒体病毒和斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ基因组全序列分析

论文摘要

杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群,呈杆状,仅感染无脊椎动物,具有大的双链,共价闭合,环状的DNA基因组。杆状病毒基因组的测序和分析对于我们理解基因功能和它们的进化是非常重要的,正是由于已经有大量的杆状病毒基因组已经被测序,方便了我们对病毒基因组的进一步的了解而进行详细的比较分析。本研究主要对两种杆状病毒:东方粘虫颗粒体病毒（PsGV）和斜纹夜蛾核型多角体病毒II（SpltNPV II）基因组进行序列测定和分析。1. PsGV和SpltNPV II的形态学特性根据包涵体形态的不同,将杆状病毒分为NPVs和GVs两类,NPVs的包涵体呈多角体形,内有多个病毒粒子,而GVs的包涵体呈颗粒体形,内只有一个病毒粒子。通过扫描电镜可以观察到纯化的PsGV的包涵体形状规则,大小比较均一,长度约为0.5μM,直径为0.3μM。通过透射电镜可以观察到每个包涵体内部有一个杆状病毒粒子,长约310nm,宽约40nm,每个病毒粒子内只有一个核衣壳。通过扫描电镜可以观察到纯化的SpltNPV II的包涵体形状不太规则,大小也不均一,直径约1.3μM。在透射电镜下可以观察到每个包涵体内部有多个杆状病毒粒子,长约260nm,宽约50nm,每个病毒粒子内含有多个核衣壳。2. PsGV的基因组全序列分析测定了东方粘虫颗粒体病毒病毒（PsGV）基因组全序列,PsGV基因组大小为176,677bp,是目前已经测序的杆状病毒基因组中仅次于XecnGV的第二大基因组。其G+C含量为39.79%,编码183个ORFs,每个ORFs大小为150核苷酸或以上,并且与其它ORF具有最小的重叠。与已经测序的AcMNPV、XecnGV和HearGV基因组进行了比较,发现PsGV与XecnGV和HearGV基因组具有很高的序列相似性和共线性,而且这三个基因组均有9个hrs,它们的结构以及在基因组中的位置都非常保守。在183个预测的ORFs中有69个与AcMNPV具有同源性,占整个基因组的37.7%;有166和169个ORFs分别与XecnGV和HearGV具有同源性,分别占整个基因组的90.7%和92.3%。PsGV与XecnGV和HearGV的同源基因的氨基酸相似性为79%,远远高于与AcMNPV同源基因的相似性（34%）。除了PsGV基因组特有的7个ORFs以外,还确定了12个bro基因、2个helicase基因和3个enhancin基因。在PsGV基因组中有两个完全一致的反向互补的重复基因（ORF39和49）,并通过PCR扩增进行了验证。通过质谱分析,在PsGV（OB）中鉴定了12个颗粒体组成蛋白,包括6个ODVs特异性蛋白组分和1个ODVs和BVs共有的蛋白组分。其中ORF174由于它的功能至今未见报道,从本研究结果可以判定其属于一种新的颗粒体组成蛋白。3. SpltNPV II的基因组全序列分析测定和分析了斜纹夜蛾核型多角体病毒（SpltNPV II）基因组全序列,表明这是一个新的杆状病毒。该基因组大小为148,634bp,G+C含量为45%,编码149个ORFs,每个ORFs大小为150核苷酸或以上,并且与其它ORF具有最小的重叠。其中141个ORFs（94.6%）与其它的杆状病毒具有一定的同源性,包括97个与AcMNPV同源,96个与SpltNPV I同源,133个与SeMNPV同源,这些同源基因的氨基酸相似性分别为41.4%、44.6%和76.5%。在SpltNPV II基因组中有8个特有的ORFs和7个hrs。除了2个bro基因以外,在SpltNPV II基因组中还有2个重复的ORFs:p26和odv-e56,系统进化分析结果表明这两个基因的每个重复的来源都不同。SpltNPV II和SpltNPV I是从相同的宿主分离到的两种杆状病毒,对它们的基因组进行了比较,包括基因组大小、ORFs数目、G+C含量、基因内容、基因顺序和氨基酸序列相似性,发现它们之间存在非常显著的差异。结合之前的杀虫效果和限制性酶切图谱分析结果（与苏州大学朱江教授交流）,认为SpltNPV II是一种不同于SpltNPV I的新病毒。4. PsGV和SpltNPV II的系统进化分析迄今为止,已知有45种杆状病毒的基因组全序列进行了测定,它们共有29个保守的基因,被认为是杆状病毒的核心基因,这些基因通常编码最基本的功能。本研究建立了基于这29个核心基因的氨基酸序列按照一定的顺序连接后的系统进化树,这个进化树支持了将杆状病毒分为鳞翅目NPVs、鳞翅目Gvs、膜翅目杆状病毒和双翅目杆状病毒的最新建议分类系统,其中鳞翅目NPVs又分为Group I和Group II。根据这个系统进化树, PsGV属于鳞翅目GVs,PsGV与HearGV和XecnGV的进化关系最近,这与本文第四章中比较的结果是一致的。从这个系统进化树还可以看出:SpltNPV II属于鳞翅目Group II NPVs,与SeMNPV关系最近。虽然SpltNPV II与SpltNPV I共同属于鳞翅目Group II NPVs,但是关系却比较远,再次验证了SpltNPV II是一个不同于SpltNPV I的新病毒。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 杆状病毒的生物学和分类学
• 1.2 杆状病毒基因组
• 1.2.1 杆状病毒基因组的测序概况
• 1.2.2 杆状病毒基因组结构
• 1.2.3. 杆状病毒的基因结构
• 1.2.4. 保守基因及其功能
• 1.2.5. 可变基因
• 1.2.6. 基因组的重组
• 1.3 杆状病毒的系统发生和进化
• 1.3.1 杆状病毒的系统发生史
• 1.3.2 杆状病毒的进化
• 第二章 本研究的立题依据、意义和研究方案
• 2.1 立题依据
• 2.2 研究意义
• 2.3 研究方案
• 第三章 东方粘虫颗粒体病毒的形态特性研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 病毒株和颗粒体病毒纯化
• 3.1.2 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 扫描电镜样品的制备
• 3.2.2 透射电镜样品的制备
• 3.3 结果
• 3.3.1 扫描电镜观察
• 3.3.2 透射电镜观察
• 第四章 东方粘虫颗粒体病毒基因组全序列分析
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 病毒株和颗粒体纯化
• 4.1.2 菌株和质粒
• 4.1.3 工具酶
• 4.1.4 试剂
• 4.1.5 培养基及有关溶液的配制
• 4.1.6 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 颗粒体病毒DNA 的提取
• 4.2.2 碱法少量快速抽提质粒DNA
• 4.2.3 碱法大量制备质粒DNA
• 4.2.4 DNA 浓度测定
• 4.2.5 限制性内切酶反应
• 4.2.6 玻璃奶法纯化回收DNA 片段
• 4.2.7 DNA 的连接
• 4.2.8 质粒DNA 的转化
• 4.2.9 重组质粒的鉴定
• 4.2.10 随机文库的建立
• 4.2.11 DNA 测序
• 4.2.12 基因组序列分析
• 4.2.13 基因组中2 个同源基因位置的确定
• 4.2.14 PsGV（ODVs）颗粒体组成蛋白的制备
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 PsGV 全基因组的核苷酸序列分析
• 4.3.2 PsGV 的ORFs 与其它杆状病毒的比较
• 4.3.3 PsGV 特有的ORF
• 4.3.4 同源区（hr）
• 4.3.5 杆状病毒的重复基因（bro genes）
• 4.3.6 PsGV 基因组中的两个同源基因
• 4.3.7 PsGV 基因组中最大的基因
• 4.3.8 PsGV 增效蛋白基因（enhancin）
• 4.3.9 PsGV（OBs）颗粒体组成蛋白分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 斜纹夜蛾核型多角体病毒II 的形态特征研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 病毒株和多角体纯化
• 5.1.2 主要仪器
• 5.2 实验方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 扫描电镜观察
• 5.3.2 透射电镜观察
• 第六章 斜纹夜蛾核型多角体病毒II 基因组全序列分析
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 病毒株和多角体纯化
• 6.1.2 菌株和质粒
• 6.1.3 工具酶
• 6.1.4 试剂
• 6.1.5 培养基及有关溶液的配制
• 6.1.6 主要仪器
• 6.2 实验方法
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 SpltNPV II 全基因组的核苷酸序列分析
• 6.3.2 SpltNPV II 的ORFs 与其它杆状病毒的比较
• 6.3.3 SpltNPV II 特有的ORFs
• 6.3.4 同源区（hr）
• 6.3.5 杆状病毒的重复基因（bro genes）
• 6.3.6 SpltNPV II 中含有两个同源序列的基因
• 6.3.7 SpltNPV II 与SpltNPV I 比较
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 第七章 PsGV 和 SpltNPV II 的系统进化分析
• 7.1 实验材料
• 7.2 实验方法
• 7.3 结果与分析
• 7.4 讨论
• 7.5 小结
• 第八章 全文结论
• 8.1 东方粘虫颗粒体病毒（PsGV）的形态特性研究
• 8.2 东方粘虫颗粒体病毒（PsGV）基因组序列分析
• 8.3 斜纹夜蛾核型多角体病毒 II（SpltNPV II）的形态特性研究
• 8.4 斜纹夜蛾核型多角体病毒 II（SpltNPV II）基因组序列分析
• 8.5 PsGV 和 SpltNPV II 的系统进化分析
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历