论文摘要
目的:研究肾虚流产模型大鼠蜕膜CD80/CD86表达的变化以及助孕3号丸对妊娠免疫调节的作用与机理,研究自然流产肾虚证的证候本质,为验证中医理论“肾主生殖”和补肾法治疗该病提供实验根据。方法:SPF级雌性大鼠,10周龄,体重200～250克,分为6组观察阴道涂片,在动情期开始以羟基脲300mg/Kg/D灌胃建立肾虚流产大鼠模型。随机分为A对照组、B模型组、C模型+西药组、D模型+中药低剂量组,E模型+中药中剂量组,F模型+中药高剂量组。第8天灌服米非司酮（RU486）,24小时后无菌低温条件下处死动物,计算胚胎数、流产率,测量胚胎直径。处死大鼠1小时内无菌条件下收集一侧子宫蜕膜预处理后采用流式细胞术测定CD80、C86、CD28、CTLA-4表达值。另一侧子宫的新鲜蜕膜组织,包埋冻存。待测PCR时,无菌取出孕鼠蜕膜组织,预处理后采用半定量RT-PCR方法检测蜕膜组织Th1型（TNF-α、IFN-γ、IL-2）/Th2型（IL-4、IL-6、IL-10）细胞因子mRNA表达。结果:孕鼠表现出中医肾虚证候,脏器指数下降,流产率升高,并出现母胎界面免疫失衡状态,经中药治疗后能纠正这种免疫失衡。1.孕鼠进食/饮水量变化情况:（1）与对照组比较,模型组大鼠造模第4天、第8天在进食量方面减少,差异有显著性（P＜0.05）。（2）与模型组比较,助孕3号丸高剂量组大鼠造模第8天进食量增加,差异有显著性（P＜0.05）。（3）与流产模型组比较,正常对照组、西药治疗组和中药中、高剂量组大鼠造模第8天在饮水量方面有显著性差异（P＜0.05）。2.孕鼠第四天和第八天的前后体重差(△W2-W1):第四天各组△W2-W1无显著性差异（P＞0.05）。而第八天时体重增幅分别是对照组＞高剂组＞西药组＞中剂组＞低剂组＞模型组,其中与正常对照组及其他治疗组比较,模型组大鼠造模第8天的体重增长量减少,差异有显著性（P＜0.05）。与模型组比较,助孕3号丸中、高剂量组和西药组大鼠造模第8天时体重增长量升高,差异有显著性（P＜0.05）。3.孕鼠脏器指数:模型组的连胎子宫脏器指数最低,其与A、C、E、F比较,有显著性差异（P＜0.05）。各组的肾脏和卵巢脏器指数无显著性差异（P＞0.05）。4.孕鼠胚胎直径和流产率:模型组大鼠的胚胎直径与其它各组之间无显著性差异（P＞0.05）。模型组的流产率与其它各组比较,均有显著性差异（P＜0.05）。B、C、D、E组的活胎数与A组比较,差异有显著性（P＜0.01）。中药中、高剂量组和西药组大鼠的流产率与模型组比较,具有显著性差异（P＜0.05）。5.蜕膜协同刺激分子表达:正常孕鼠母胎界面CD80/CD86、CD28均呈低表达,而CTLA-4呈现高表达;但肾虚流产大鼠母胎界面CD80/CD86、CD28表达均上升,CTLA-4表达下降。经治疗后,和模型组比较西药组和助孕3号丸高剂组的CD80/CD86、CD28表达均下调,差异有显著性（P＜0.05）,CTLA-4表达上调,差异有显著性（P＜0.05）。6.肾虚流产大鼠母胎界面会上调Th1型细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-2）表达而下调Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）表达,而模型组经助孕3号丸可抑制Th1型细胞因子表达,而促进Th2型细胞因子表达。结论:1.肾虚流产模型表现出肾阳虚衰中医证候,并表现为母胎界面免疫微环境失衡,其导致流产发生的机制可能为CD28、CD80/CD86的病理性高表达和CTLA-4表达不足,而同时Th1型细胞因子高表达而Th2型细胞因子表达不足,从而CD28和CD80/CD86结合产生的协同刺激信号导致Th网络平衡向Th1型偏倚、发生免疫排斥所致。2.助孕3号丸安胎作用机制可能体现在上调母胎界面CTLA-4表达,使协同刺激分子CD80/CD86和CD28表达下调,并阻抑CD28与CD80/CD86结合产生协同刺激信号,进而使Th1型细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-2）表达下调,Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）表达上调,促进母胎界面细胞因子网络平衡向Th2型偏倚,降低母体免疫排斥,增强了母胎免疫保护,最终降低肾虚流产模型大鼠的流产率,而达到防治流产的作用,使得妊娠得以正常维持。研究可为补肾中药助孕3号丸治疗自然流产提供实验依据。
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