论文题目: 高温胁迫和鳗弧菌感染对栉孔扇贝基因表达影响的分析及相关基因的克隆与表达
论文类型: 博士论文
论文专业: 海洋生物学
作者: 胡晓丽
导师: 包振民
关键词: 栉孔扇贝,色氨酸双加氧酶,肌球蛋白
文献来源: 中国海洋大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究采用mRNA差异显示技术分析了高温胁迫和鳗弧菌感染对栉孔扇贝基因表达的影响。克隆了栉孔扇贝色氨酸双加氧酶（TDO）,HSP70和肌球蛋白基因,并进行了表达分析。 采用3条锚定引物和8条随机引物组成24对引物组合,对高温胁迫前后栉孔扇贝基因表达变化进行了mRNA差异显示分析。在2599条扩增条带中,有59条差异条带,其中,9条在胁迫样本中特异扩增,20条只在对照样本中扩增,13条在胁迫样本中高水平扩增,17条在胁迫样本中低水平扩增。三种锚定引物H-T11A,H-T11C,H-T11G的扩增条带总数分别为867条,865条和867条,而差异条带数占相应锚定引物总扩增条带数的比例分别为1.61%,1.84%和3.34%,特异条带数占相应锚定引物总扩增条带数的比例分别是:0.58%,0.81%和1.96%,H-T11G均明显高于H-T11A和H-T11C。 同样利用mRNA差异显示技术,采用24对引物组合,分析了鳗弧菌应激前后栉孔扇贝基因表达的变化。共扩增得到2047条扩增条带,其中差异条带为32条。6条条带在胁迫样本中特异扩增,2条只在对照样本中扩增,9条在胁迫样本中高水平扩增,15条在胁迫样本中低水平扩增。三种锚定引物H-T11A,H-T11C,H-T11G的扩增条带总数分别为755条,613条和679条,而差异条带数占相应锚定引物总扩增条带数的比例分别为1.10%,1.79%和1.91%。特异条带数占相应锚定引物总扩增条带数的比例分别是:0.26%,0.33%和0.59%,H-T11G均高于H-T11A和H-T11C。 克隆了在鳗弧菌应激条件下,表达量减少的TDO基因片断,并利用5’RACE技术得到了基因全长。栉孔扇贝TDO基因全长1292 bp,编码383个氨基酸,分子量为44.8KD,等电点为6.35。编码的氨基酸序列与果蝇、人、斑马鱼、小鼠和线虫TDO的相似性分别为61%,57%,56%,55%和54%,并含有可能与TDO酶活性有关的保守性组氨酸。在大肠杆菌中表达了TDO-GST融合蛋白,并用融合蛋白制备了多克隆抗体。RT-PCR及Western blotting结果表明,栉孔扇贝TDO在鳃、消化腺、外套膜、闭壳肌、肾和性腺中都有表达。免疫组化分析显示,TDO
论文目录:
第一章 文献综述
1 养殖扇贝大规模死亡的相关因素
1．1 环境因素
1．2 病原微生物
2 应激反应相关蛋白及基因研究进展
2．1 热休克蛋白70(HSP70)
2．1．1 HSP70的分子结构
2．1．2 HSP70的生物学功能
2．1．3 HSP70基因研究进展
2．2 色氨酸双加氧酶(TDO)
2．2．1 TDO生物功能
2．2．2 TDO基因研究进展
2．3 其它相关蛋白及基因研究进展
2．3．1 金属硫蛋白
2．3．2 溶菌酶
2．3．3 抗菌肽
3 肌球蛋白及其基因研究进展
3．1 肌球蛋白结构及分类
3．2 肌球蛋白功能
3．3 肌球蛋白基因研究进展
4 目的基因筛选的常用技术
4．1 差减杂交与抑制性差减杂交
4．2 代表性差异分析
4．3 基因表达系列分析
4．4 cDNA微阵列技术
4．5 差异显示反转录PCR
第二章 应激前后栉孔扇贝基因表达差异分析
0 前言
第一节 高温胁迫对栉孔扇贝基因表达影响的分析
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 工具酶
1．1．2 引物
1．1．3 试剂
1．2 方法
1．2．1 栉孔扇贝RNA提取
1．2．2 琼脂糖电泳
1．2．3 总 RNA样品中微量DNA的去除
1．2．4 反转录合成cDNA第一链
1．2．5 DDRT-PCR
1．2．6 DDRT-PCR产物的丙稀酰胺凝胶电泳分析
2 结果
2．1 总 RNA提取结果
2．2 扩增条带类型
2．3 不同引物组合的差异显示结果不同
2．4 高温胁迫处理前后栉孔扇贝基因表达差异比较
3 讨论
第二节 鳗弧菌胁迫对栉孔扇贝基因表达影响的分析
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验动物
1．2 方法
2 结果
2．1 不同引物组合扩增结果比较
2．2 鳗弧菌应激前后栉孔扇贝基因表达差异比较
3 讨论
第三章 栉孔扇贝色氨酸加氧酶基因克隆及表达
0 前言
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验动物
1．1．2 工具酶
1．1．3 引物
1．1．4 载体
1．1．5 菌株
1．1．6 试剂
1．2 方法
1．2．1 差异片断回收
1．2．2 差异片断二次扩增
1．2．3 制备大肠杆菌DH5α感受态细胞
1．2．4 差异片断克隆
1．2．5 克隆筛选
1．2．6 测序
1．2．7 RT-PCR
1．2．8 合成5′-RACE-Ready cDNA
1．2．9 5′RACE扩增
1．2．10 5′RACE扩增产物克隆测序
1．2．11 PCR扩增TDO完整ORF
1．2．12 酶切PCR产物和pGEX-4T-3质粒
1．2．13 琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物
1．2．14 连接酶切后的PCR产物与载体
1．2．15 转化连接产物至BL21(DE3)
1．2．16 测序
1．2．17 诱导表达TDO
1．2．18 SDS-PAGE电泳
1．2．19 融合蛋白的纯化
1．2．20 包涵体的变性复性
1．2．21 抗体制备
1．2．22 Western Blotting
1．2．23 组织总蛋白提取
1．2．24 免疫组化
2 结果
2．1 差异片断回收克隆
2．2 RT-PCR
2．3 5′RACE扩增
2．4 TDO ORF扩增结果
2．5 诱导表达TDO-GST融合蛋白
2．6 TDO-GST融合蛋白包涵体变性复性
2．7 抗血清特异性检测
2．8 RT-PCR
2．9 western blotting
2．10 免疫组化
3 讨论
3．1 获得基因全长的方法的选择
3．2 栉孔扇贝TDO序列分析
3．3 应激与TDO表达关系的分析
3．4 栉孔扇贝TDO基因的融合表达
3．5 包涵体蛋白的溶解复性
3．6 抗血清的特异性
3．7 栉孔扇贝TDO组织表达
3．8 栉孔扇贝TDO的细胞分布
第四章 栉孔扇贝HSP70基因克隆及3′UTR序列变化与栉孔扇贝抗逆能力关系分析
0 前言
第一节 栉孔扇贝HSP70基因克隆
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验动物
1．1．2 引物
1．2 方法
1．2．1 总 RNA提取
1．2．2 3′RACE cDNA第一链合成
1．2．3 扩增 HSP70 cDNA序列
1．2．3 基因组 DNA提取
1．2．S PCR扩增Hsp70基因片断
1．2．6 目的片断克隆
1．2．7 RT-PCR
2 结果
2．1 HSP70基因cDNA扩增结果
2．2 栉孔扇贝HSP70基因cDNA序列
2．3 HSP70基因DNA扩增产物结果
2．4 栉孔扇贝HSP70基因DNA序列
2．5 RT-PCR
3 讨论
第二节 栉孔扇贝个体内HSP70 3′UTR序列变化与抗逆能力关系分析
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验动物
1．1．2 引物
1．1．3 试剂
1．2 方法
1．2．1 基因组DNA提取
1．2．2 PCR扩增栉孔扇贝3′UTR
1．2．3 PCR产物丙稀酞胺电泳检测
1．2．4 PCR产物WAVE系统检测
1．2．5 混合 PCR产物梯度变性退火
1．2．6 克隆测序
2 结果
2．1 扩增产物的电泳检测
2．2 扩增产物的非变性PAGE检测
2．3 三群体扩增产物的WAVE检测
2．4 不同抗性群体个体内HSP70 3′UTR序列变异统计
2．5 个体内HSP70 3′UTR序列变化与耐热能力的关系
2．6 栉孔扇贝HSP70 3′ UTR内富含AU的序列
3 讨论
3．1 个体内插入缺失和点突变的检出
3．2 不同抗性群体HSP70基因3′UTR序列变异分析
3．3 热激条件下野生栉孔扇贝抗逆能力与HSP70基因3′UTR变异关系分析
第五章 肌球蛋白基因克隆及表达分析
0 前言
1 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 实验动物
1．1．2 引物
1．1．3 工具酶
1．1．4 试剂
1．2 方法
1．2．1 总RNA提取
1．2．2 合成cDNA第一链
1．2．3 PCR扩增肌球蛋白基因片断
1．2．4 克隆目的片断
1．2．5 3′RACE及5′RACE扩增
1．2．6 克隆RACE扩增片断
1．2．7 RT-PCR分析栉孔扇贝肌球蛋白Ⅵ组织表达
1．2．8 栉孔扇贝外套膜肌球蛋白Ⅵ在大肠杆菌中的表达
1．2．9 SDS-PAGE
2 结果
2．1 栉孔扇贝外套膜肌球蛋白基因片断RT-PCR结果
2．2 序列测定及所编码氨基酸序列同源性比较
2．3 RACE扩增结果
2．4 RT-PCR分析
2．5 栉孔扇贝肌球蛋白Ⅵ基因部分序列在大肠杆菌中的表达
3． 讨论
参考文献
致谢
发布时间: 2005-10-26
参考文献
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