仿刺参肠道菌群多样性研究

论文摘要

随着仿刺参人工养殖的快速发展,其病害问题也日益突出。目前主要使用抗生素预防和治疗仿刺参的疾病,抗生素的添加不当和残留会危害到人类和环境的安全。仿刺参肠道微生物具有重要的生理功能,为保证仿刺参的食用安全性,找到安全合适的微生态制剂替换抗生素,首先需要了解仿刺参肠道的微生物组成。本文首先用传统的培养方法分析了仿刺参肠道可培养细菌的组成。选用Zobell、葡萄糖（海水）和TCBS三种培养基,通过细菌的分离纯化、16S rDNA序列测定及系统发育分析,对大连地区仿刺参肠道可培养细菌进行研究,结果表明：从大连地区仿刺参肠道中分离得到的细菌分属于10个菌属,分别为：假单胞菌属（Pseudomonas）,弧菌属（Vibrio）,芽孢杆菌属（Bacillus）,希瓦氏菌属（Shewanella）,交替假单胞菌属（Pseudoalteromonas）不动杆菌属（Acinetobacter）,气球菌属（Aerococcus）,发光菌属（Photobacterium）,葡萄球菌菌属（Staphylococcus）和 Kushneria菌属。优势菌属为假单胞菌属（Pseudomonas）仿刺参前肠的细菌无论在数量上还是种类上都不如后肠丰富,但前后肠的优势菌属均为假单胞菌属（Pseudomonas）。冬季仿刺参肠道优势菌属是芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas）。春季仿刺参肠道中优势菌属只有假单胞菌属（Pseudomonas）由于自然界中大部分的微生物是无法培养的,本文摸索了构建仿刺参肠道细菌16SrDNA克隆文库的条件,绕过培养障碍,更加全面的了解仿刺参肠道菌群的多样性。用细菌基因组试剂盒提取肠道细菌总DNA,得到DNA浓度为170μg/mL。用通用引物27f、1492r对基因组DNA进行扩增,条件：94℃ 5 min; 94℃ 1 min; 50℃ 1 min; 72℃2 min,30个循环；72℃ 10 min下扩增出的片段较理想。将扩增产物经试剂盒回收纯化后,以1：3的摩尔比与T载体pMD-18连接,转入至E.coli DH5 α感受态细胞中进行表达,获得白斑168个,转化效率为71%。随机挑取65个白色单菌落进行验证,其中成功克隆转化的有37个,阳性克隆率为57%。阳性克隆经过HinfⅠ和HaeⅢ限制性内切酶分析后得到6个可操作分类单元（OTUs）,克隆文库库容覆盖率Coverage C值为94.6%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 仿刺参
• 1.1.1 仿刺参概况
• 1.1.2 仿刺参的营养价值与功效
• 1.2 仿刺参的人工养殖
• 1.2.1 养殖现状
• 1.2.2 养殖中出现的问题
• 1.2.3 微生态制剂在水产养殖中的应用
• 1.3 肠道菌群
• 1.3.1 肠道菌群的作用
• 1.3.2 肠道菌群的研究现状
• 1.4 微生物的多样性的研究方法
• 1.4.1 培养依赖法
• 1.4.1.1 传统的分离培养方法
• 1.4.1.2 传统培养方法的缺陷
• 1.4.1.3 传统的细菌鉴定方法
• 1.4.1.4 基于16S rDNA序列分析的细菌鉴定方法
• 1.4.2 不依赖培养的分子技术
• 1.4.2.1 DNA提取技术
• 1.4.2.2 构建16S rDNA克隆文库的分析方法
• 1.4.2.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）
• 1.4.2.4 限制性片段长度多态性（RFLP）分析
• 1.5 本论文的研究内容与意义
• 第二章 传统细菌分离培养方法研究仿刺参肠道菌群多样性
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 实验样品
• 2.2.2 主要培养基
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 主要试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 样品的处理
• 2.3.2 可培养细菌的培养和分离
• 2.3.3 细菌的鉴定
• 2.3.3.1 细菌的菌落及菌体形态观察
• 2.3.3.2 生理生化试验
• 2.3.3.3 16S rDNA序列分析
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 仿刺参肠道细菌的培养和分离
• 2.4.2 仿刺参肠道细菌的生理生化试验
• 2.4.3 16S rDNA序列分析
• 2.4.3.1 DNA的提取
• 2.4.3.2 16S rDNA片段的扩增
• 2.4.3.3 16S rDNA序列的测定及系统发育树的构建
• 2.4.4 仿刺参肠道细菌菌相分析
• 2.4.4.1 仿刺参前后肠道菌相组成
• 2.4.4.2 不同季节仿刺参肠道菌相组成
• 第三章 16S RDNA克隆文库分析仿刺参肠道菌群多样性
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验样品
• 3.2.2 主要培养基
• 3.2.3 主要仪器
• 3.2.4 主要试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 样品处理
• 3.3.2 肠道总细菌DNA提取
• 3.3.3 16S rDNA片段的扩增
• 3.3.4 PCR产物的纯化
• 3.3.5 构建16S rDNA克隆文库
• 2法制备感受态细胞'>3.3.5.1 CaCl₂法制备感受态细胞
• 3.3.5.2 PCR产物与T载体的连接
• 3.3.5.3 转化
• 3.3.5.4 阳性克隆的筛选
• 3.3.5.5 限制性片段多态性分析和系统发育分析
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 肠道总细菌DNA提取
• 3.4.2 16S rDNA片段的扩增及纯化
• 3.4.3 构建16S rDNA克隆文库
• 3.4.3.1 连接和克隆转化
• 3.4.3.2 阳性克隆的筛选
• 3.4.3.3 限制性片段多态性分析
• 3.4.3.4 构建16S rDNA克隆文库过程的探讨
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢