论文摘要
Erbin是2000年通过酵母双杂交发现的一种新的HER2相互作用蛋白,属于LAP （LRR and PDZ domains）蛋白家族成员,其N端包含16个LRR结构域,C端含1个PDZ结构域。Erbin的生物学功能目前仍未完全阐明。已知Erbin定位于细胞膜及相邻细胞的连接处,参与细胞的极性形成、维持上皮细胞内环境的稳定、参与HER2等分子的细胞内定位。近年来发现,Erbin还参与细胞的信号转导,Erbin可抑制MAPK信号通路以及Nod2依赖的NF-κB信号通路。本研究第一部分首先通过RT-PCR从MCF7细胞中钓取了Erbin的全长编码序列,由于目前尚无商品化的抗Erbin抗体,我们构建了原核表达载体pET28a-Erbin PDZ,表达并纯化了Erbin PDZ重组蛋白,用纯化的Erbin PDZ重组蛋白免疫小鼠,获得了高效价的抗血清,并对抗体的特异性和敏感性进行了鉴定。实验结果表明,我们制备的抗体可用于ELISA、Western blot、免疫荧光和免疫组化实验。抗Erbin抗体的制备为下一步研究Erbin的功能奠定了基础。我们用此抗体检测了4种乳腺癌细胞系及其它常用细胞系内源性Erbin的表达,发现Erbin的丰度在不同细胞内具有明显差异。免疫荧光及免疫组化染色结果显示,Erbin在间期细胞内呈膜及胞质分布,主要定位于质膜。然而,在分裂期的细胞中Erbin似表达明显增强,且其细胞内的定位亦发生变化,呈明显的全细胞分布。为解析Erbin在细胞周期中差异表达及细胞内定位变化的意义,第二部分的研究从分析不同细胞周期Erbin表达的变化入手,初步探讨了Erbin在细胞周期中作用的分子机制。通过Western blot和半定量RT-PCR,我们发现Erbin在mRNA及蛋白水平均呈细胞周期依赖性表达,其表达量在G2/M期最高,G0/G1期最低,S期介于两者之间。Erbin在G2/M期不仅表达增强,而且其定位亦发生了显著的变化,可见Erbin出现于分裂期细胞核内。免疫荧光染色、共聚焦显微镜观察结果表明,Erbin在M期细胞中的定位呈动态变化,在分裂前期,Erbin与凝聚的染色质相伴或定位于染色质中心区;在分裂中期,Erbin可定位于纺锤体,且主要浓集于纺锤体的两极;在分裂后期,Erbin集聚于卵裂沟;在分裂末期,Erbin定位于细胞相连处。在稳定表达Erbin PDZ-GFP融合蛋白的MCF7细胞中,外源性Erbin PDZ在分裂前期及前中期聚集于染色质中心区,在分裂中期及后期均定位于纺锤体,主要浓集于极区。在胞质分裂期,Erbin PDZ清楚地定位于中间体。免疫共沉淀和Western blot证实Erbin与β-tubulin在G2/M存在相互作用。Erbin与Ras/MEK/ERK信号通路的关系已有报道。我们通过共聚焦显微镜观察分析了M期中Erbin与Ras、MEK和ERK信号分子的关系。结果表明,Erbin与Ras、MEK和ERK在分裂前期、前中期和中期均具有明显的共定位特征。免疫共沉淀实验证实,在M期Erbin可与Ras、MEK及ERK形成复合物,推测Erbin可能通过与信号分子相互作用形成分子复合物,参与细胞分裂活动。细胞内蛋白沿微管移动需要驱动蛋白及动力蛋白的参与,Erbin定位于纺锤体两极,表明它向微管负极移动,提示Erbin在M期可能作为微管负向运动的驱动蛋白的货物。为发现可能与Erbin相互作用的驱动蛋白,我们应用计算机辅助分子模拟、免疫共沉淀及质谱分析,发现Erbin在G2/M期与Dynein存在相互作用,应用Erbin特异性的siRNA抑制Erbin表达后,Dynein与MEK/ERK不能发生共沉淀。抑制Erbin的表达亦可明显影响细胞的增殖。总之,我们发现了Erbin参与细胞分裂的新功能。在M期,Erbin作为支架蛋白与Ras/MEK/ERK信号分子形成复合物,成为Dynein的货物（cargo）,从胞质转移至核内,并将信号复合物携至M期纺锤体。在Dynein的驱动下,沿微管向纺锤体极区移动,从而参与细胞分裂过程。本研究结果为支架蛋白参与MAPK信号传递的机制研究提供了新线索,亦为ERK信号通路在G2/M期中的意义提供了新的证据。
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