论文题目: 利用T-DNA插入突变和RNA干涉技术研究水稻基因功能
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 彭昊
导师: 黄大昉,路铁刚
关键词: 干涉,类受体激酶,水稻,增强子捕获
文献来源: 中国农业科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一,同时也是单子叶植物和禾谷类作物分子生物学研究的模式植物。目前水稻基因组序列测定工作已经基本完成,预测的编码基因超过40,000个。已测定的水稻全长cDNA克隆数目也已经超过32,000个。确定这些基因的功能将是今后研究的中心任务。鉴于根癌农杆菌介导的水稻遗传转化方法近年来日趋成熟,利用转基因的方法获得突变体被认为是水稻功能基因组学研究的主要途径之一。本研究利用T-DNA插入突变和RNA干涉技术创制水稻突变体,并根据突变体的表型来研究相应基因的功能和表达模式。 本研究是中国高技术研究发展计划项目“水稻突变体库的创制与功能基因组学研究”和国家自然科学基金项目“水稻受体激酶功能及其与环境信号分子的作用”的一部分,通过与合作者的共同努力,取得了以下主要研究进展: 建立了一套高效快速的根癌农杆菌介导的水稻遗传转化程序,从诱导成熟胚来源的愈伤组织开始,约90d后即可得到转化植株。获得潮霉素抗性愈伤组织的效率超过90%,由抗性愈伤组织分化再生植株的效率超过80%,PCR和Southern杂交检测表明大约95%的潮霉素抗性植株含有T-DNA插入片段。提高转化效率的关键在于降低共培养温度至19～22℃,并在选择培养10～15d后及时选择继代培养4～12d。利用上述程序构建了大规模的水稻增强子捕获突变体库。 评估了GAL4/VP16-UAS-GUS增强子捕获系统在水稻中的效率。对9,120株独立增强子捕获标签系的T1代未成熟种子进行了GUS染色分析,观察并统计了胚,胚乳和种皮中GUS基因的表达频率。约40%的标签系在其中至少一个部位呈GUS阳性反应。从阳性标签系中随机挑选出212个样品,进行T1代幼苗（根和叶）的GUS染色分析,约70%的样品在其中至少一个部位呈GUS阳性反应。利用PCR walking技术从这212个样品中分离扩增T-DNA插入位点的侧翼序列,共得到127条水稻基因组侧翼序列,并对T-DNA的插入位点和整合模式进行了详细的分析。根据插入位点的侧翼序列信息预测基因和启动子,并随机挑选了10个预测的启动子进行表达模式分析,有6个启动子表现出与原增强子捕获标签系相同的GUS表达模式。上述结果表明GAL4/VP16-UAS-GUS增强子捕获系统是一种分离水稻基因表达调控元件和研究水稻基因表达模式的有效方法。 利用T-DNA插入引入RNA干涉系统的方法,对一些预测的水稻类受体激酶基因进行功能分析。通过对RNA干涉植株的筛选,发现了1个新的与稻瘟病抗性相关的类受体激酶基因（RK41）。利用Southern和Northern杂交检测从T0代RK41基因RNA干涉植株中筛选出了T-DNA为单拷贝插入且RK41基因表达量明显降低的株系用于进一步的分析。对该株系的T1代RNA干涉植株和RK41基因的T0代过量表达植株进行了RT-PCR检测,结果表明抑制RK41基因的表达后,水稻对稻瘟菌（Magnaporthe grisea）的敏感性增加,而过量表达RK41基因可以增强水稻对稻瘟病的抗性,即RK41基因的表达水平和水稻的稻瘟病抗性直接相关。
论文目录:
第一章 文献综述
1.1 水稻基因组学研究概述
1.2 水稻T-DNA插入突变技术研究进展
1.2.1 T-DNA插入与基因敲除
1.2.2 T-DNA激活标签技术
1.2.3 T-DNA捕获标签技术
1.2.4 T-DNA插入位点侧翼序列的分离
1.3 RNA干涉技术研究进展
1.3.1 RNA干涉的作用机制
1.3.2 RNA干涉的参与因子
1.3.3 RNA干涉的功能和意义
1.3.4 RNA干涉技术的特点和方法
1.3.5 RNA干涉技术在植物中的应用
1.4 植物类受体激酶基因研究进展
1.5 本研究的意义和技术路线
第二章 利用T-DNA插入构建水稻增强子捕获突变群体
2.1 材料与方法
2.1.1 水稻转化所用双元载体
2.1.2 水稻材料和成熟胚来源的愈伤组织诱导
2.1.3 胚性愈伤组织的转化
2.1.4 潮霉素抗性愈伤组织筛选和植株再生
2.1.5 再生植株的PCR和Southern杂交检测
2.2 结果
2.2.1 水稻遗传转化的效率及其影响因素
2.2.2 再生植株的PCR和Southern杂交检测
2.3 讨论
第三章 水稻增强子捕获突变群体的功能分析
3.1 材料与方法
3.1.1 GAL4／VP16-UAS-GUS系统的增强子捕获功能
3.1.2 水稻组织的GUS组织化学染色
3.1.3 T-DNA插入位点侧翼序列的分离
3.1.4 侧翼序列的测定
3.1.5 侧翼序列的同源性查找和启动子预测
3.1.6 预测启动子的功能分析
3.2 结果
3.2.1 T_1代种子和幼苗中GUS基因的表达模式
3.2.2 T-DNA侧翼序列的扩增
3.2.3 T-DNA侧翼序列的结构分析
3.2.4 T-DNA插入位点的分析
3.2.5 启动子的预测和表达模式分析
3.2.6 T-DNA插入与GUS染色表型的共分离分析
3.3 讨论
第四章 水稻类受体激酶基因的RNA干涉分析
4.1 材料与方法
4.1.1 水稻用RNA干涉诱导载体和基因过量表达载体的构建
4.1.2 类受体激酶基因RNA干涉、过量表达和启动子检测载体的构建
4.1.3 稻瘟菌接种
4.1.4 Southern杂交
4.1.5 Northern杂交
4.1.6 RT-PCR检测
4.2 结果
4.2.1 水稻用RNA干涉诱导载体和基因过量表达载体的构建
4.2.2 类受体激酶基因RNA干涉载体的构建
4.2.3 稻瘟菌筛选RNA干涉突变体及相应LRR-RLK基因的结构分析
4.2.4 RK41基因T_0代RNA干涉植株的Southern和Northern检测
4.2.5 RK41基因T_1代RNA干涉植株的RT-PCR和抗瘟性检测
4.2.6 RK41基因过量表达载体的构建
4.2.7 RK41基因过量表达植株的RT-PCR和抗瘟性检测
4.2.8 RK41基因表达模式的检测
4.2.9 其它LRR-RLK基因的RNA干涉突变体
4.3 讨论
结论及创新点
参考文献
致谢
作者简历
发布时间: 2005-09-05
参考文献
- [1].水稻长叶毛基因Hairy Leaf 6的图位克隆与功能分析[D]. 孙文强.华中农业大学2017
- [2].水稻CCT家族基因的功能研究和Hd1的重新克隆[D]. 章佳.华中农业大学2017
- [3].miR396调控水稻产量的分子机理研究[D]. 高峰.武汉大学2015
- [4].fsv1水稻胚珠发育过程中基因表达及不育机理研究[D]. 杨丽玉.武汉大学2016
- [5].水稻OsSEC18和OsVPS37基因的功能研究[D]. 孙允芳.武汉大学2013
- [6].GWAS定位水稻苗期耐冷基因和抗白叶枯基因[D]. 王丹.湖南农业大学2017
- [7].两个水稻叶形基因的精细定位及遗传分析[D]. 张小惠.四川农业大学2016
- [8].不同水稻品种对氮素响应的差异及其农艺生理性状[D]. 剧成欣.扬州大学2017
- [9].水稻穗颈伸长基因EUI2（t）的精细定位与克隆[D]. 朱宏波.福建农林大学2003
- [10].分子标记辅助选择技术在水稻抗病育种中的应用[D]. 陈志伟.福建农林大学2004
相关论文
- [1].农杆菌介导的转座子水稻突变体库的构建[D]. 朱正歌.中国农业科学院2001
- [2].T-DNA标签在水稻基因组中的分布与特征[D]. 陈双燕.浙江大学2003
- [3].RNAi抑制水稻WRKY10基因表达及转铁蛋白水稻铁胁迫耐受性分析[D]. 窦彩虹.浙江大学2005
- [4].三个与水稻株型相关突变体的鉴定与基因克隆[D]. 汪得凯.中国农业科学院2005
- [5].水稻中控制形态结构建成相关基因的功能研究[D]. 张淑红.复旦大学2005
- [6].水稻种子发育相关转录因子的分离和功能研究[D]. 叶锐.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2005
- [7].水稻基因激活标签体系的建立及初步分析[D]. 宛淑艳.中国农业科学院2006
- [8].水稻标签库突变体筛选与分析[D]. 张治国.中国农业科学院2006