论文摘要
目的:肝癌是原发于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤之一。在肿瘤的发病中,原发性肝癌在我国男性居第三位,女性居第四位.中国每年约有12万人死于肝癌。由于其恶性度极高,现有的治疗方法均达不到满意的效果,寻找有效的治疗药物和方法是目前肝癌治疗的一项重要课题。越来越多的证据表明,中医药在防治肝癌的发病及改善患者的免疫状态、提高患者生存率方面有其独特疗效。许多中药具有诱导细胞凋亡（APO）、影响DNA、RNA合成及保持相关酶活性的作用。健脾理气方是临床常用验方,探讨健脾理气方对肝癌作用的机制,为中药治疗肝癌提供可靠的依据已成为当务之急。方法:以中药血清学方法测定健脾理气方药物血清对人肝癌HepG2细胞株作用的最佳量效、时效点;以倒置相差显微镜、光镜、透射电镜观察经健脾理气方药物血清处理后的人肝癌HepG2细胞株的形态学变化,以流式细胞化学方法研究人肝癌HepG2细胞株在健脾理气方药物血清的影响下细胞形态学变化及联合DNA琼脂凝胶电泳法检测细胞凋亡典型的梯状带分析;以Western blot法测定经药物血清处理后的人肝癌HepG2细胞株P53、bcl-2基因的蛋白表达水平;以酶细胞化学染色方法观察健脾理气方药物血清对人肝癌HepG2细胞株Mg2+-ATP酶、G-6-P酶活性的影响。结果:以不同时相药物血清作用人肝癌HepG2细胞株后,除2t-1h组药物血清未见明显增殖抑制作用,其余各组均表现明显抑制作用,以3t-2h组药物血清抑制作用最好,抑制率达54.81%,以不同浓度药物血清作用24h、48h后,除中药中小剂量药物血清作用24h组外,其余各组均表现明显的抑制作用,以中药大剂量药物血清作用48h组抑制作用最佳,抑制率达53.96%;倒置相差显微镜下,经药物血清处理后的HepG2细胞彼此失去连结,收缩变圆,贴壁能力减弱,易从培养瓶上脱落下来,光镜下观察药物血清作用后,细胞收缩变圆,部分细胞出现固缩,细胞核染色质聚集,断裂成块状、颗粒状或月形小体,细胞形态呈凋亡特征性改变,电镜下,经药物血清处理的HepG2细胞,表面微绒毛减少甚至消失,核染色质浓集,胞质内有空泡形成,细胞膜起皱呈出芽状,可见凋亡小体形成,以DNA琼脂凝胶电泳法检测,健脾理气方药物血清能诱导人肝癌HepG2细胞形成凝胶电泳特异梯状带,以流式细胞化学方法定量分析健脾理气方药物血清作用24、48h,在G1峰前出现的明显凋亡峰（Ap峰）,测得凋亡细胞占整个细胞群分别为1.8%和8.2%;人肝癌HepG2细胞株经药物血清处理前后蛋白表达Western-Blot结果显示,P53蛋白表达水平增高、bcl-2蛋白表达水平降低;经健脾理气方药物血清处理后,光镜下见用药组人肝癌HepG2细胞株Mg2+-ATPase和G-6-Pase酶反应颗粒较正常变小,数量减少,密度减低,酶活性下降。结论:1.健脾理气方药物血清对人肝癌HepG2细胞株体外具有抑制肿瘤细胞增殖的作用,作用的最佳量效、时效点为大剂量,3t-2h;2.健脾理气方药物血清对人肝癌HepG2细胞株具有诱导细胞凋亡的作用;3.健脾理气方药物血清可上调人肝癌HepG2细胞株P53基因的蛋白表达水平,下调bcl-2基因的蛋白表达水平;4.健脾理气方药物血清具有降低人肝癌HepG2细胞株Mg2+-ATP酶和G-6-P酶的活性的作用。