骨髓间充质干细胞和体细胞的共微囊化研究

论文摘要

骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源丰富、易分离纯化且具有多向分化潜能、可自体移植,是作为种子细胞移植的研究热点。微胶囊具有良好的免疫隔离性能和生物相容性,为干细胞大规模、高活性体外培养及长期保存提供了技术支持。共微囊化技术则利用干细胞与体细胞间的相互接触与支持作用为细胞移植疗法开辟了一种新途径。本文制备了载BMSCs细胞的海藻酸钙-几丁聚糖-海藻酸钙（ACA）微胶囊,考察了其理化力学性能及生物相容性。共微囊化BMSCs/肝细胞（Chang liver）,考察细胞代谢性能。共微囊化BMSCs/胰岛β细胞（Beta-TC-6）用于治疗Ⅰ型糖尿病,并在分子水平探讨其机理。首先,体外培养BMSCs细胞,绘制其细胞生长曲线。然后采用免疫细胞组织化学染色方法鉴定其表面抗原CD29、CD44、CD117,检测结果为CD29呈阳性,CD44呈阳性,CD117呈阴性,成骨诱导分化实验结果也表明BMSCs在体外培养时具有分化的能力。其次,采用高压静电法制备载BMSCs细胞的ACA微胶囊,优化制备工艺为:两步法制备,海藻酸钠浓度1.75%（w/v）,成膜时间10min,细胞密度1×106个/mL。制出的载BMSCs微囊球形度好、表面光滑,粒径主要分布在300400μm间且7天内随时间变化不大,机械强度较好且囊内细胞分布均匀、活性高,破囊后重新培养的BMSCs细胞生长良好。再次,考察体外培养的微囊化BMSCs细胞的活性（CCK-8法）,发现与平板培养和非液化核心的微囊化细胞相比,液化核心的微囊更适于细胞的长期生长。体外培养的第15天,细胞密度达到峰值为4.3×107个/mL。将载BMSCs细胞的微囊植入小鼠腹腔考察微胶囊的体内生物相容性,观察发现小鼠生理活动正常,未见毒性症状,体重增长平稳。28天内回收微囊,微囊表面光滑,球形度好,未出现纤维化或巨噬细胞聚集现象。然后,采用平板、微囊化、共培养及共微囊化四种培养方式来培养肝细胞（Chang liver）,以白蛋白及尿素分泌量为检测指标考察比较肝细胞的代谢性能。结果表明,四组分泌白蛋白量及尿素的大小关系均为:共微囊化BMSCs/Chang liver组> BMSCs/Chang liver组>微囊化Chang liver组> Chang liver细胞组。15天内,共微囊化BMSCs/Chang liver组白蛋白分泌量最高为3.08 mg/mL。11天内,尿素分泌量最高为3.75 mmol/L。最后,制备微囊化胰岛β细胞（Beta-TC-6）及共微囊化BMSCs/Beta-TC-6细胞,测定比较28天内胰岛素分泌量。第28天,共微囊化组分泌胰岛素含量为98.60 pg/mL。将两种微囊化细胞植入Ⅰ型糖尿病小鼠体内,监测比较其降血糖作用。结果表明,两者均能在28天内明显降低糖尿病小鼠的血糖,且共微囊化组具有更良好的效果,移植后的第28天,微囊化Beta-TC-6细胞组及共微囊化BMSCs/Beta-TC-6细胞组糖尿病小鼠血糖浓度分别为5.08 mmol/L和6.08 mmol/L。采用RT-PCR的方法检测细胞胰岛素mRNA表达水平,结果表明BMSCs与胰岛β细胞在微囊微环境中共培养后能在其诱导下在一定程度上分化为胰岛素分泌细胞。本研究证明了微胶囊可以为骨髓间充质干细胞诱导分化成成体细胞提供微环境,共微囊化骨髓间充质干细胞和体细胞用于移植治疗疾病具有潜在应用前景。

论文目录

• 论文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 骨髓间充质干细胞
• 1.2 微囊化骨髓间充质干细胞
• 1.2.1 生物微胶囊
• 1.2.2 干细胞及其微囊化
• 1.2.3 骨髓间充质干细胞及其微囊化
• 1.3 共微囊化细胞
• 1.4 本论文的研究工作
• 第二章 小鼠 BMSCS的体外培养与诱导分化
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 小鼠BMSCs 的传代培养
• 2.3.2 小鼠BMSCs 生长曲线的绘制
• 2.3.3 小鼠BMSCs 的细胞表面抗原鉴定
• 2.3.4 小鼠BMSCs 的成骨诱导分化
• 2.4 结果讨论
• 2.4.1 小鼠BMSCs 的形态学观察
• 2.4.2 小鼠BMSCs 细胞生长曲线的建立
• 2.4.3 小鼠BMSCs 的细胞表面抗原鉴定及诱导分化
• 2.5 小结
• 第三章 载细胞微胶囊的制备及性能考察
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与仪器
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器与装置
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 载BMSCs 细胞微胶囊制备条件的选择
• 3.3.2 载BMSCs 细胞微胶囊制备方法的选择
• 3.3.3 载BMSCs 细胞微胶囊性能考察
• 3.3.4 载BMSCs 细胞微胶囊的观察
• 3.3.5 化学破囊后的细胞再培养
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 载BMSCs 细胞微胶囊制备条件的选择
• 3.4.2 载BMSCs 细胞微胶囊制备方法的选择
• 3.4.3 载BMSCs 细胞微胶囊的性能考察
• 3.4.4 载BMSCs 细胞微胶囊的形态观察
• 3.4.5 化学破囊后的细胞再培养
• 3.5 小结
• 第四章 载细胞微胶囊的生物相容性
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 BMSCs 的标准曲线的绘制
• 4.3.2 微囊化BMSCs 细胞的体外培养
• 4.3.3 载细胞微胶囊的体内生物相容性
• 4.3.4 载细胞微囊的腹腔回收
• 4.4 结果讨论
• 4.4.1 BMSCs 细胞标准曲线的建立
• 4.4.2 微囊化BMSCs 细胞的体外培养
• 4.4.3 载细胞微囊的体内生物相容性
• 4.4.4 载细胞微囊的腹腔回收及观察
• 4.5 小结
• 第五章 共微囊化 BMSCs和肝细胞的体外培养
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料与仪器
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 Chang liver 的传代培养与细胞生长曲线测定
• 5.3.2 共微囊化BMSCs / Chang liver 细胞的制备
• 5.3.3 共微囊化细胞白蛋白分泌量检测
• 5.3.4 共微囊化细胞尿素合成含量检测
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 Chang liver 细胞生长曲线的测定
• 5.4.2 共微囊化细胞形态观察
• 5.4.3 共微囊化细胞白蛋白分泌量及尿素合成含量测定
• 5.5 小结
• 第六章 共微囊化 BMSCs和胰岛细胞的实验研究
• 6.1 引言
• 6.2 实验材料与仪器设备
• 6.2.1 实验材料
• 6.2.2 实验仪器
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 Beta-TC-6 细胞及BMSCs 细胞的体外培养
• 6.3.2 共微囊化BMSCs / Beta-TC-6 细胞的制备
• 6.3.3 共微囊化细胞胰岛素分泌量测定
• 6.3.4 共微囊化细胞植入治疗I 型实验性糖尿病
• 6.3.5 RT-PCR 检测细胞胰岛素mRNA 表达水平
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 Beta-TC-6 细胞及BMSCs 细胞的体外培养
• 6.4.2 共微囊化细胞胰岛素分泌量测定
• 6.4.3 共微囊化细胞植入后小鼠血糖和体重监测
• 6.4.4 细胞胰岛素mRNA 表达水平及比较
• 6.5 小结
• 第七章 总结
• 7.1 结论
• 7.2 后续工作建议
• 参考文献
• 致谢
• 附录：发表论文及参加会议情况