miR-10b在鼻咽癌转移中的功能和调控机制研究

论文摘要

研究背景和目的鼻咽癌是中国南方和东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一,以明显的区域分布特征、与EB病毒的密切关系以及强烈的转移倾向显著区别于其他头颈部肿瘤。转移是鼻咽癌治疗失败的主要原因,尽管诊疗技术不断进步,但由于60-85%的患者确诊时已发生临床转移,鼻咽癌的5年生存率提升缓慢,探究鼻咽癌转移的分子机制,寻找新的治疗靶点,减少转移的发生,是我们面临的巨大挑战。LMP-1是鼻咽癌最重要的外源性癌基因,也是鼻咽癌最重要的促转移基因。在鼻咽癌中,LMP-1发挥类似肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factorreceptor,TNFR）的功能,通过激活NF-κB,AP-1,ets-1,MAPKs,JAK/STAT,PI3K/Akt等不同信号通路,对E-cadherin,MMPs,c-Met,VEGF,EGFR,COX-2等多个转移相关基因的调控,影响着鼻咽癌转移的几乎每个环节。沉默LMP-1能够减少鼻咽癌细胞转移。miRNA（microRNA）是广泛存在于生物体内的19-25nt的非编码RNA。转录完成后,miRNA与靶mRNA的3’UTR的互补序列结合,通过抑制mRNA的翻译或直接降解mRNA调控基因表达。人类基因组编码的miRNA多达1000个,参加了包括胚胎形成、发育、代谢和重大疾病在内的几乎所有生命活动。一些miRNA能够影响细胞凋亡、增殖与分化,扮演着癌基因的角色,被称为oncomirs。肿瘤转移是一个及其复杂的生物学过程,包括上皮细胞去极化,细胞间黏附改变,运动性增强,基底膜穿透,血管生成等一系列变化,涉及了大量信号通路激活和多个基因的表达变化。这一过程同样离不开miRNA对基因表达的精准调控。我们对oncomirs在肿瘤转移中的功能和作用机制还知之甚少,最新研究发现,miR-17-92家族,miR-200家族,miR-205,miR-29C,miR-21,Let-7等oncomirs在肿瘤转移过程中,也发挥着重要作用。miR-10b促进乳腺癌转移的发现更是备受瞩目。Ma和同事等发现miR-10b仅在高转移的乳腺癌细胞中表达,阻断miR-10b能够使MDA-MB-231细胞侵袭能力下降90%以上,而不具备转移能力的SUM149细胞过表达miR-10b后,在裸鼠体内发生远处转移。临床资料也表明,发生转移的乳腺癌患者,miR-10b表达高于非转移组。这一研究还发现。乳腺癌细胞中miR-10b的表达,正是由转录因子Twist启动的。Twist属于碱性的螺旋-环-螺旋（Helix-loop-helix）蛋白家族中高度保守的转录因子,可以调节胚胎发育过程中的组织重建,并赋予细胞迁移的能力,也是促进多种肿瘤的转移与侵袭的关键基因,在鼻咽癌的转移中也发挥重要作用。Horikawa T.等发现LMP-1能够诱导转录因子Twist,促进鼻咽癌转移和侵袭。据此我们提出研究假说:miR-10b受LMP-1/Twist信号通路调控,在鼻咽癌进展过程中发挥促进转移的功能。为了证实这一假说,我们首先检测miR-10b在鼻咽癌组织和不同的鼻咽癌细胞中的表达水平,分析miR-10b表达与细胞转移能力的关系,并观察LMP-1和Twist的表达变化对miR-10b的影响。利用pre-miR-10b慢病毒表达载体,在鼻咽癌细胞中过表达miR-10b,或转染miR-10b抑制剂阻断miR-10b,分析其表达变化对细胞周期、增殖、凋亡,移动、侵袭和体内转移能力的影响,以初步探讨鼻咽癌转移中miR-10b的功能和作用机制。方法1.鼻咽癌组织和细胞中miR-10b的检测收集鼻咽癌组织标本45例（其中转移26例,未转移19例）,慢性鼻咽炎组织16例作对照。所有新鲜鼻咽癌组织标本分为2份,一份经10%甲醛固定,包埋、切片免疫组化染色检测LMP-1表达情况。另一份标本液氮冻存,制作冰冻切片,用原位杂交检测miR-10b表达。2.鼻咽癌细胞中miR-10b的检测长期携带EB病毒基因的人类低分化鼻咽癌细胞株C666-1,高分化鼻咽癌细胞CNE1,低分化鼻咽癌细胞CNE2、HONE1、HNE-1细胞,以及SUNE-1细胞的高转移亚株5-8F和不转移亚株6-10B,永生化鼻咽上皮细胞株NP69细胞,8株细胞分别采用荧光定量PCR和原位杂交检测miR-10b表达。3.沉默及过表达LMP-1表达合成能够转录出LMP-1干扰模板的双链DNA片段,插入shRNA的表达载体pAVU6+27,获得pAVU6+27/shLMP-1质粒。以空pAVU6+27载体为对照,分别转染C666-1细胞后,通过G418筛选和巢式PCR检测获得LMP-1阴性的亚株C666/shLMP-1。含有N-LMP-1 cDNA的质粒pCR?Ⅱ-TOPO/LMP-1,用Lipofectamine-2000转染细胞,48h后RT-PCR检测LMP-1mRNA水平。4.miRNA提取和Real time PCR检测按照mirVana miRNA isolation kit说明书进行操作,富集分子量小于200nt的小分子RNA。按照TaqMan MicRNA RT Kit说明书操作,采用TaqMan MicRNAAssays中的逆转录引物,以cDNA为模板,进行逆转录反应,U6 RNA作为内对照。5.制备慢病毒载体稳定过表达miR-10b根据miR-10b前体pre-mir-10b（MI000681）的序列,在5’端和3’端引入Mlu I和Cla I的酶切位点,合成全长102bp的pre-mir-10b转录模板,连接转化,挑取重组阳性克隆,经PCR、Mlu I和Xba I双酶切鉴定,鉴定正确的质粒送DNA测序。采用脂质体法将慢病毒包装系统中3种质粒按比例共转染293FT细胞,收集上清液,离心过滤后,得到慢病毒悬液。病毒悬液连续稀释法计算病毒滴度。慢病毒pLVTHM/miR-10b和空病毒载体pLVTHM感染鼻咽癌细胞。采用流式细胞仪分选出GFP（+）细胞扩大培养。Real PCR检测miR-10b表达水平。6.siRNA及anti-miR转染细胞融合度达到40%左右,更换无血清培养基。将anti-miR充分溶解于不含有血清的转染专用培养基Opti-MEM中。阳离子脂质体Lipofectamine2000用Opti-MEM稀释后,与siRNA或anti-miR溶液混合,轻轻振荡后,置于室温20min,加入细胞培养板。37℃孵育4h后,加入30%胎牛血清FBS,继续培养24h,48h,72h后,荧光定量PCR方法检测miR-10b表达水平的变化。7.miR-10b报告基因质粒的构建和双荧光报告实验以基因组DNA为模板扩增出将含有miR-10b种子区互补序列的片段作为miR-10b结合位点,将片段插入psiCHECK-2质粒海肾荧光素Renilla下游XhoI和NotI位点之间。用Lipofectamine-2000将psiCHECK-2/miR-10b-binding质粒anti-miR,同时转染细胞,24h后按照Dual-Luciferase Reporter Assay System的说明进行样品的Luciferase活性检测,根据荧光素比值:Luciferaseactivity（Renilla/Firefly）变化分析miRNA inhibitor抑制miR-10b的效果。8.细胞增殖实验细胞以每孔1×103个细胞接种于96孔培养板中,每孔体积200μl,每组5孔,同时设空白对照（仅加培养基）,分别培养1-5天。每孔加入5mg/ml的MTT20μl,37℃继续培养4h后终止培养,加入DMSO,酶标仪上570nm测定各孔吸光度值（OD值）,以相对应OD比值表示细胞增殖能力大小。各组取5孔平均值,绘制增殖曲线。9.流式细胞实验C666/shLMP-1和C666/shLMP-1/miR-10b细胞,0.25%胰酶消化,PBS洗涤3次后调整细胞浓度为5×105/ml的细胞悬液,离心后,按照BD公司荧光染色试剂盒说明书,进行荧光标记,流式细胞仪进行细胞周期检测。10.划痕实验在6孔细胞培养板中,每组细胞作3个复孔。待细胞密度达到90%左右,吸干培养基,用同样大小的加样枪头,垂直在培养孔中部轻轻划过,制造多条相互平行的划痕,力度以刮落细胞而不在培养板上留痕为准。培养液冲去脱落细胞后继续培养。每个孔随即选取9个有划痕穿过的视野,在不同时间点,对越过划痕边缘向空白出移动生长的细胞进行计数,独立实验重复3次。11.侵袭实验采用美国BD公司的肿瘤细胞基底膜穿透实验系统Biocoat MatrigelInvasion Chambers,按照说明书操作,C666-1细胞胰酶消化后,以无血清培养基种植与小室内5.0×103/孔,24孔细胞培养板,每孔中预先加入含有10%胎牛血清的培养基0.5ml,然后将培养杯置入孔中培养。不同时间后取出小室,棉签拭去基底膜正面的细胞,将部分小室基底膜沿杯底剪下翻转,用甲苯胺蓝对能够穿透基底膜的细胞进行染色,显微镜下计数。12.体内转移实验建立肝被膜下种植肺转移动物模型。4～6周龄BALB/c nu/nu裸鼠48只,鼻咽癌细胞调制成2×106/ml细胞悬液,用1ml注射器于裸鼠肝包膜下缓慢注入0.1ml细胞悬液,全层缝合腹壁。其中36只裸鼠随机分成2组,分别接种C666/shLMP-1和C666/shLMP-1/miR-10b细胞,每组18只,其中每组随机取9只用于观察抗肿瘤效果,其余9只用于生存期观察。另外12只裸鼠分成2组,每组6只,分别接种过表达miR-10b的HNE1和HNE1/miR-10b细胞。用于生存期观察的18只裸鼠,观察活体动物体内荧光分布,能够了解肿瘤细胞在体内扩散的情况。并继续饲养至自然死亡,记录生存期。用于观察抗肿瘤效果的18只裸鼠第三周末断髓处死,立即取荷瘤裸鼠肝脏及肺脏组织,PBC冲洗2次,用动物整体成像系统下观察带荧光的肿瘤组织分布情况,并拍照。荧光照相后的肝脏及肺脏组织,用10%甲醛固定,常规石蜡包埋HE染色,显微镜下观察肿瘤细胞在肝脏内成瘤情况,以及肺、腹膜等器官肿瘤转移情况。13.统计学处理采用SPSS 13.0软件对数据进行分析,均以P＜0.05表示差异有显著性意义。免疫组化和原位杂交结果采用X2检验以及两独立样本非参数秩和检验Mann-Whitney U法进行统计学分析。荧光定量PCR和细胞周期实验,样本均数比较采用,两独立样本的t检验（independent-samples T test）或单因素方差分析（One-way ANOVA）,多重比较采用SNK法（Student-Neuman-Keuls）。方差不齐者采用基于方差不齐的多重比较方法Dunnett’s T3法进行。MTT实验、体外侵袭实验、划痕实验采用析因设计的方差分析。动物生存时间分析采用Kaplan-Meier法,肺转移、肝内转移和腹水情况的比较采用X2检验。结果1.miR-10b的表达与鼻咽癌转移以及LMP-1的关系①miR-10b表达与鼻咽癌发病在全部45例鼻咽癌组织中,miR-10b表达率为80%（36/45）,主要定位于细胞核,鼻咽慢性炎症组织中表达率为56.25%（9/16）,二者无显著差异（X2=3.441,P=0.097）。②miR-10b表达与鼻咽癌转移将45例鼻咽癌组织按照确诊时有无淋巴结或远处转移分为转移组（26例）和未转移组（19例）,鼻咽癌转移组miR-10b的表达较强（Z=-3.243,P=0.001）。③miR-10b表达与LMP-145例鼻咽癌组织中,LMP-1阳性率为37.78%（17/45）,LMP-1（+）组miR-10b的表达较强（Z=-2.013,P=0.044）。在LMP-1阳性组的中转移者miR-10b表达高于未转移者（Z=-2.504,P=0.012）,而LMP-1阴性组中转移和未转移者的miR-10b表达没有统计学差异（Z=-1.857,P=0.063）。2.miR-10b表达水平与细胞转移能力和LMP-1表达的相关性①.miR-10b在转移的鼻咽癌细胞中高表达7种鼻咽癌细胞株与永生化人鼻咽上皮细胞NP69相比较,miR-10b在8株细胞中的表达存在显著差异（F=96.395,P=0.000）,具备转移能力的C666-1和5-8F细胞表达水平高于其他5种不转移的鼻咽癌细胞。原位杂交显示C666-1和5-8F细胞miR-10b表达为阳性,6-10B和HONE-1细胞为阴性,与荧光定量PCR检测结果一致。②miR-10b表达水平与LMP-1一致RT-PCR结果显示,转染pCR?Ⅱ-TOPO/LMP-1 C666/LMP-1细胞LMP-1mRNA较C666-1明显提高。转染C666/shLMP-1细胞中LMP-1稳定沉默。LMP-1沉默的C666/shLMP-1细胞miR-10b表达明显下降,而过表达LMP-1的C666/LMP-1的miR-10b表达提高明显提高,LMP-1含量与miR-10b表达呈一致变化。3.miR-10b过表达鼻咽癌细胞株的建立由于LMP-1是鼻咽癌主要的外源性癌基因,为了排除LMP-1基因表达变化对细胞的影响,我们利用LMP-1沉默的C666/shLMP-1细胞进行miR-10b的功能研究。首先利用慢病毒载体系统在中过表达miR-10b,制备了miR-10b稳定过表达的慢病毒载体pLVTHM/pre-miR-10b,感染C666/shLMP-1细胞48-72h后,阳性C666-1细胞发出绿色荧光,经流式细胞仪分选出带荧光的细胞经反复传代后,miR-10b水平比感染pLVTHM空载体C666/shLMP-1最多提高45倍,成为稳定过表达的亚克隆细胞C666/shLMP/miR-10b。4.miR-10b过表达对C666-1细胞增殖和细胞周期的影响MTT结果和流式细胞实验表明,C666/shLMP-1和C666/shLMP-1/miR-10b细胞的体外增殖能力及细胞周期均无显著性差异。5.miR-10b过表达对鼻咽癌细胞体外侵袭和移动能力的影响基底膜穿透实验和划痕实验表明过表达miR-10b的C666/shLMP-1/miR-10b细胞侵袭和移动能力较对照组增强。miR-10b过表达提高鼻咽癌细胞体外侵袭和移动能力6.miR-10b过表达对鼻咽癌细胞体内侵袭、移动和生存时间的影响接种C666/shLMP-1和C666/shLMP-1/miR-10b鼻咽癌细胞的裸鼠,3周后肝脏成瘤率达100%,其中C666/shLMP-1/miR-10b组动物全部出现种植瘤肝内广泛转移腹水出现时间较早（X2=5.556,P=0.018）,肺转移发生率均高于C666/shLMP-1组（X2=5.844,P=0.016）,生存时间较C666/shLMP-1组缩短（X2=5.526,P=0.019）。而接种HNE1/miR-10b和HNE1组也可在局部成瘤,但均未发现肝内播散和肺转移。说明miR-10b过表达提高鼻咽癌细胞体内侵袭和移动能力。7.miR-10b抑制物阻断miR-10b表达对鼻咽癌细胞转移能力的影响荧光报告检测结果表明,miR-10b抑制物（anti-miR-10b）与转染后,只有C666/shLMP/miR-10b侵袭能力增强（t=-5.509,P=0.000）,而C666/shLMP-1和C666/control侵袭能力无明显变化（图-6）。说明anti-miR-10b能够逆转由于miR-10b过表达造成的侵袭能力提高,而对于miR-10b表达很低的C666/shLMP-1没有影响,同样对于LMP-1阳性C666/control,单独抑制miR-10b也不足以改变其转移能力。8.LMP-1通过Twist基因诱导miR-10b表达利用RNA干扰抑制Twist的表达,分析LMP-1是否通过Twist启动miR-10b转录。Twist siRNA转染C666-1细胞72小时后,Twist mRNA含量下降超过87.4%。LMP-1（+）的C666/control（t=7.060,P=0.002）和C666/LMP细胞（t=7.564,P=0.002）中miR-10b均下降,而LMP-1（-）的C666/shLMP（t=-0.579,P=0.594）和C666/shLMP/miR-10b细胞（t=-0.090,P=0.932）miR-10b的含量没有明显变化。说明LMP-1诱导miR-10b的表达,很可能是通过转录因子Twist实现的。结论:1.miR-10b在转移的鼻咽癌组织和细胞中高表达,表达水平与EB病毒LMP-1基因相关。2.miR-10b的过表达能够促进鼻咽癌细胞体外和体内转移能力,但对细胞增殖、凋亡及细胞周期没有影响。3.LMP-1基因通过转录因子Twist调控miR-10b表达,鼻咽癌中可能存在LMP-1/Twist/miR-10b促转移信号传导通路。4.miR-10b在鼻咽癌转移分子机制研究中有重要意义,可以作为判断预后指导治疗的生物学标记,但能否作为基因治疗靶点不能定论。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 技术路线
• 第一章 miR-10b在鼻咽癌细胞和组织中的表达
• 1.1 材料与设备
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 参考文献
• 第二章 miR-10b过表达对鼻咽癌细胞生物学特性的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 参考文献
• 第三章 miR-10b沉默对鼻咽癌转移能力的影响
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 第四章 鼻咽癌细胞中miR-10b的调控通路的初步研究
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 攻读学位期间成果
• 致谢