TRAIL在脑缺血再灌注致神经元凋亡中的作用及GDNF（△N39）-R9穿过血脑屏障的探讨

论文摘要

脑卒中的发病率、致残率及死亡率都相当高。临床上挽救脑卒中患者的最有效方法是早期恢复血液再灌注。但脑缺血超过一定时间后，恢复再灌注可造成神经细胞的进一步损伤，加重患者的病情，即再灌注损伤。探讨脑缺血再灌注损伤的机制，对减轻脑缺血损伤和提高人类的生存质量极其重要。脑缺血再灌注损伤的炎症免疫机制研究将为临床寻找有效的治疗方法提供重要的思路。众多研究表明，TNFα、FasL等细胞因子在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用。TRAIL是肿瘤坏死因子家族新成员。有研究发现，TRAIL可诱导体外培养神经元凋亡，但有关TRAIL在脑缺血再灌注损伤中发挥的作用及其机制研究尚未见报道。本课题拟利用原代神经细胞培养检测正常神经元对TRAIL的敏感性及炎性因子对该作用的影响；采用小鼠全脑缺血模型，通过检测TRAIL及其受体的表达及利用可溶性DR5特异性封闭TRAIL的作用，从正、反两方面，体内、体外实验研究TRAIL在脑缺血再灌注损伤所致神经细胞凋亡中的作用，并取得了一定的研究成果。目前虽已发现了诸如胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）等多种蛋白及肽类药物对脑细胞有保护作用，但大分子蛋白类药物如何穿过血脑屏障到达脑组织并达到有效治疗浓度的问题却一直未得到解决。传统的解决方法包括侧脑室注射、局部脑内植入，均具损伤性，对脑缺血患者不宜反复使用。近来研究发现，来自于人类免疫免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV-Ⅰ）的Tat蛋

论文目录

中文摘要

英文摘要

符号说明

第一部分 TRAIL在脑缺血再灌注致神经元凋亡中的作用及其机制研究

前言

第一章 TRAIL诱导皮层神经元凋亡的体外研究

材料与方法

1.材料

2.方法

2.1 小鼠大脑皮层神经元的体外培养及鉴定

2.1.1 小鼠大脑皮层神经元的体外培养

2.1.2 小鼠大脑皮层神经元的鉴定

2.2 小鼠大脑皮层神经元对TRAIL敏感性的检测及IFN-γ的影响

2.2.1 小鼠大脑皮层神经元对TRAIL敏感性的检测

2.2.1.1 倒置相差显微镜下观察形态学变化

2.2.1.2 CCK-8检测细胞杀伤率

2.2.2 IFN-γ对小鼠大脑皮层神经元对TRAIL敏感性的影响

2.2.2.1 倒置相差显微镜下观察形态学变化

2.2.2.2 CCK-8检测细胞杀伤率

结果

1 小鼠大脑皮层神经元的体外培养与鉴定

1.1 原代培养小鼠大脑皮层神经元的形态学特点

1.2 皮层神经元特异性烯醇化酶鉴定结果

2 小鼠大脑皮层神经元对TRAIL敏感性的检测及IFN-γ的影响

2.1 小鼠大脑皮层神经元对TRAIL敏感性的检测

2.1.1 倒置相差显微镜下形态学变化

2.1.2 CCK-8检测细胞杀伤率

2.2 IFN-γ对小鼠大脑皮层神经元对TRAIL敏感性的影响

2.2.1 倒置相差显微镜下形态学变化

2.2.2 CCK-8检测细胞杀伤率

讨论

第二章 TRAIL在小鼠全脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制研究

第一节小鼠全脑缺血再灌注模型的建立及相应指标检测

材料与方法

1.材料

2.方法

2.1 全脑缺血再灌注动物模型的建立

2.2 全脑缺血前后脑血流量的变化

2.3 动物脑组织取材

2.4 TUNEL检测细胞凋亡

2.5 半定量RT-PCR检测炎性因子的表达

结果

1.全脑缺血后脑血流量及神经病学症状的变化

2.TUNEL检测细胞凋亡

3.RT-PCR检测炎性因子的表达

3.1 全脑缺血再灌注后TNFα在小鼠海马和大脑皮层的表达

3.1.1 全脑缺血再灌注后TNFα在小鼠海马的表达

3.1.2 全脑缺血再灌注后TNFα在小鼠大脑皮层的表达

3.2 全脑缺血再灌注后IFN-γ在小鼠海马和大脑皮层的表达

3.2.1 全脑缺血再灌注后IFN-γ在小鼠海马的表达

3.2.2 全脑缺血再灌注后IFN-γ在小鼠大脑皮层的表达

3.3 全脑缺血再灌注后ICAM-1在小鼠海马和大脑皮层的表达

3.3.1 全脑缺血再灌注后ICAM-1在小鼠海马的表达

3.3.2 全脑缺血再灌注后ICAM-1在小鼠大脑皮层的表达

讨论

第二节 TRAIL及其受体在小鼠全脑缺血再灌注损伤中的表达

材料与方法

1.材料

2 方法

2.1 动物分组及模型制备

2.2 半定量RT-PCR检测TRAIL及其受体mRNA水平的表达

2.3 免疫组织化学双荧光染色检测TRAIL及DR5的表达及细胞定位

2.4 免疫组织化学与TUNEL共染检测DR5表达与细胞凋亡的相关性

2.5 激光共聚焦检测

2.6 ELISA法测定血清中sTRAIL浓度

结果

1.全脑缺血再灌注后TRAIL及其受体mRNA水平的表达

1.1 全脑缺血再灌注后TRAIL mRNA水平的表达

1.1.1 全脑缺血再灌注后小鼠海马TRAIL mRNA水平的表达

1.1.2 全脑缺血再灌注后小鼠大脑皮层TRAIL mRNA水平的表达

1.2 全脑缺血再灌注后DR5mRNA水平的表达

1.2.1 全脑缺血再灌注后小鼠海马DR5mRNA水平的表达

1.2.2 全脑缺血再灌注后小鼠大脑皮层DR5mRNA水平的表达

1.3 全脑缺血再灌注后DcR1mRNA水平的表达

1.3.1 全脑缺血再灌注后小鼠海马DcR1mRNA水平的表达

1.3.2 全脑缺血再灌注后小鼠大脑皮层DcR1mRNA水平的表达

1.4 全脑缺血再灌注后DcR2mRNA水平的表达

2.免疫双染激光共聚焦检测TRAIL在脑内的表达

2.1 TRAIL、GFAP免疫双染

2.2 TRAIL、ED1免疫双染

2.3 TRAIL、NSE免疫双染

3.免疫双染激光共聚焦检测DR5在神经元和星形胶质细胞的表达

3.1 NSE与DR5免疫共染

3.2 GFAP与DR5免疫共染

3.3 TUNEL与DR5免疫共染

4.血清中sTRAIL检测

第三节 sDR5特异性封闭TRAIL对缺血再灌注损伤神经元的保护作用

材料与方法

1.材料

2.方法

2.1 sDR5蛋白对TRAIL诱导凋亡的封闭效应

2.1.1 sDR5蛋白的制备、纯化和定量

2.1.2 sDR5蛋白对TRAIL诱导小鼠大脑皮层神经元凋亡的封闭作用

2.1.2.1 显微镜下观察小鼠大脑皮层神经元的形态学变化

2.1.2.2 CCK-8检测细胞杀伤率

2.2 sDR5蛋白对体外低氧低糖再灌注损伤小鼠大脑皮层神经元的保护作用

2.2.1 体外低氧低糖再灌注损伤模型的建立

2.2.2 sDR5蛋白对体外低氧低糖再灌注损伤大脑皮层神经元保护作用

2.2.2.1 显微镜下观察小鼠大脑皮层神经元的形态学变化

2.2.2.2 TUNEL检测细胞凋亡的变化

2.2.2.3 CCK-8法检测细胞存活率

2.3 sDR5对体内缺血再灌注损伤神经元的保护作用

2.3.1 动物分组

2.3.2 侧脑室注射药物

2.3.3 TUNEL检测细胞凋亡

结果

1.sDR5蛋白的浓度测定及活性鉴定

1.1 sDR5蛋白的鉴定和浓度测定

1.2 sDR5蛋白阻断TRAIL诱导小鼠大脑皮层神经元细胞毒效应

2.sDR5蛋白对缺血再灌注损伤神经元的保护作用

2.1 sDR5对体外低氧低糖再灌注损伤大脑皮层神经元的保护作用

2.2 sDR5对体内缺血再灌注损伤神经元的保护作用

讨论

第二部分 GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白穿过血脑屏障的研究

前言

材料与方法

1.材料

2.方法

2.1 GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白表达载体的构建

2.1.1 基因片段的PCR扩增、回收及纯化

2.1.1.1 PCR扩增GDNF（ΔN39）-R9基因片段

2.1.1.2 GDNF（ΔN39）-R9基因片段的大量扩增、回收与纯化

2.1.2 目的基因与载体的连接和重组子的转化

2.1.2.1 目的基因与载体的酶切、回收与纯化

2.1.2.2 目的基因GDNF（ΔN39）-R9与载体pET28a（+）的连接

2.1.2.3 重组质粒pET28a（+）-GDNF（ΔN39）-R9的转化

2.1.3 阳性重组子pET28a（+）-GDNF（ΔN39）-R9的筛选与鉴定

2.1.3.1 试剂盒小量抽提质粒

2.1.3.2 PCR反应筛选阳性重组子pET28a（+）-GDNF（ΔN39）-R9

2.1.3.3 酶切筛选阳性重组子pET28a（+）-GDNF（ΔN39）-R9

2.1.3.4 DNA自动测序与序列分析鉴定阳性重组子

2.2 GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白表达、纯化、复性及定量

2.2.1 GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白诱导表达

2.2.2 GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白溶解性分析

2.2.3 GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白的亲和层析纯化和复性

2.2.4 GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白浓度测定

2.3 GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白生物学功能检测

2.3.1 GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白神经营养活性的检测

2.3.1.1 对原代培养中脑多巴胺能神经元的作用

2.3.1.2 对PC12-GFRα1-Ret细胞突起生长的影响

2.3.2 GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白穿越细胞膜及血脑屏障模拟物能力检测

2.3.2.1 免疫细胞荧光染色、激光共聚焦显微镜观察及Western-blot检测GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白穿越细胞膜的能力

2.3.2.2 Transwell检测GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白穿越血脑屏障模拟物的能力

2.3.2.2.1 Transwell模型的建立

2.3.2.2.2 免疫共沉淀/Western Blot检测GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白穿越血脑屏障模拟物能力

结果

1.GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白表达载体的构建

1.1 GDNF（ΔN39）-R9基因片段的PCR扩增、回收及纯化

1.1.1 PCR扩增基因片段

1.1.2 回收、纯化PCR产物

1.2.pET28a（+）-GDNF（ΔN39）-R9表达载体的构建及鉴定

1.2.1 目的基因GDNF（ΔN39）-R9和载体pET28a（+）的酶切回收

1.2.2 目的基因GDNF（ΔN39）-R9与载体pET28a（+）的连接、转化

1.2.3 阳性重组子pET28a（+）-GDNF（ΔN39）-R9的筛选和鉴定

1.2.3.1 PCR反应鉴定阳性重组子pET28a（+）-GDNF（ΔN39）-R9

1.2.3.2 酶切筛选阳性重组子pET28a（+）-GDNF（ΔN39）-R9

1.2.3.3 DNA自动测序与序列分析

2.GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白的表达、纯化、复性及定量

3.GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白生物学功能检测

3.1 GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白神经营养活性检测

3.1.1 对原代培养中脑多巴胺能神经元的作用

3.1.2 对PC12-GFRα1-Ret细胞突起生长的影响

3.2 GDNF（ΔN39）-R9穿越细胞膜及血脑屏障模拟物能力检测

3.2.1 GDNF（ΔN39）-R9融合蛋白穿越脑血管内皮细胞膜能力检测

3.2.2 Transwell检测GDNF（ΔN39）-R9穿越血脑屏障模拟物的能力

讨论

附图

参考文献

致谢

发表论文与专著

学位论文评阅及答辩情况表

TRAIL在脑缺血再灌注致神经元凋亡中的作用及GDNF（△N39）-R9穿过血脑屏障的探讨

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢