华南地胆草植物的居群遗传结构与精油成分变异分析 ——兼论系统发育与进化分析方法及其应用

论文摘要

地胆草属（Elephantopus L.）为菊科（Asteraceae）斑鸠菊族（Vernonieae）植物，约30余种，多集中分布于新热带地区（Neotropics），旧世界（the Old World）亦有分布。我国仅有2种，即地胆草（E.scaber L.）和白花地胆草（E.mollis Kunth.），其中地胆草为该属模式种。主要分布于我国南方和东南地区，香港和台湾也有分布。全草入药，有清热解毒、消肿利尿之功效，治感冒、痢疾、胃肠炎、扁桃体炎、咽喉炎、肾炎水肿、结膜炎、疖肿等症。我们用ISSR分子标记研究了华南地区（包括广东、海南和香港）地胆草和白花地胆草的遗传多样性及其居群结构。基于11个ISSR引物的地胆草8个居群共184个个体产生了247条条带，其中243条为多态性条带，有效条带百分率（P）为98.4％。14个ISSR引物的白花地胆草7个居群共148个个体产生了277条条带，其中246条为多态性条带，有效条带百分率（P）为88.8％。对地胆草而言，平均的遗传多样性在物种水平和在居群水平分别为0.283和0.103；而白花地胆草为0.188和0.089，与相同生活史植物的平均值相比，均显示了较高的遗传多样性。AMOVA分析显示地胆草和白花地胆草居群的遗传变异主要存在于居群间。居群间的基因流系数Nm分别为0.095和0.138，说明居群间的基因流非常少，居群遗传分化较强。地胆草和白花地胆草居群邻接树（NJ）都显示了来自海南岛的居群单独聚为一组，与其物理上的隔离分布一致。虽然Mantel检验并未显示地胆草和白花地胆草的遗传距离与地理距离具有相关性，但却显示两个物种具有相关的遗传式样。很多研究表明由于自然生态环境的变迁和人为活动的干扰，自然界分布的许多植物的生境都遭到破坏，形成生境的片断化甚至生境的完全丧失，致使这些植物的分布范围愈来愈窄，个体数量不断下降，而不同生态小环境下可导致不同居群遗传结构的显著差异，因而我们认为高度城市化所带来的生境片断化可能与地胆草和白花地胆草居群的遗传结构相关。我们的研究也从植物的遗传多样性这个侧面反映了城市化进程的影响。我们还采用水蒸气蒸馏法和二氯甲烷（CH2Cl2）萃取法提取，气相色谱—质谱联用（GC—MS）技术鉴定了地胆草和白花地胆草的精油成分。从广东阳江地区采集的地胆草全株提取的精油中，共分离出29个成分，鉴定出21个化合物。其中的主要成分为hexadecanoic acid（42.3％），isopropyl dimethyl tetrahydronaphthalenol（14.1％），β-sesquiphellandrene（8.3％），octadecadienoic acid（5.5％）和phytol（5.2％）。地胆草精油分析得到的成分这β-Sesquiphellandrene是很多植物中重要的倍半萜内碳氢化合物，具有抗病毒活性作用，亦可作为祛痰剂、杀虫剂和驱白蚁剂。基于12个地胆草居群和9个白花地胆草居群精油的共有成分中，石竹烯（又称丁香烯）及其氧化物是一类重要的倍半萜烯化合物，包括β-Caryophyllene、Isocaryophyllene和Caryophyllene oxide。这类化合物在很多重要的药用植物的中挥发油中均有出现，且发挥重要功效。基于12个地胆草居群的精油成分变异可以得到两个化学型：一个为富含脂肪酸hexadcanoic acid和octadecadienoic acid型，另一个则为富含5种烷烃同系物（alkane homologues）型。9个白花地胆草居群可以分为Tetramerhylhexadecenol含量偏高的居群和Tetramerhylhexadecenol含量偏低的居群，因而可以得到白花地胆草的一个化学型，即富含Tetramerhylhexadecenol型。Mantel统计检验表明精油的化学成分与地理距离和遗传距离均不相关，原因可能是由于精油的主要成分是由植物的遗传特性决定，但其含量依赖于生长环境与采摘季节，因而变化幅度较大。植物遗传特性在精油成分上的影响在其后的个体精油成分聚类分析中也有所反映。此外，本文作者结合所在实验室的多项合作研究课题，对系统发育分析方法及其应用问题进行了探讨，包括基于常用的遗传多样性数据构树软件，结合地胆草和白花地胆草的遗传多样性数据分析，编制了一套适用于二元数据构建NJ居群树，并带有自展支持率的计算机程序；基于NMR技术新解出的酵母Urml蛋白结构，研究了参与多个细胞进程，广泛存在于真核细胞和人体内细胞的一类大分子——泛素与类泛素超家族的进化起源，从结构和序列上推断出Urml保留了该超家族最多的祖先性状，从而认为它是泛素超家族的祖先类型；通过测定我国特有植物斑子麻黄的叶绿体matK和rbcL基因以及核糖体18S基因和ITS区的序列，选取麻黄属15个物种的16个类群（含旧大陆8种和新大陆7种）进行分子系统发育分析，探讨斑子麻黄的系统位置。基于最大简约法（MP）、邻接法（N）、最小进化法（ME）和最大似然法（ML）的独立与联合分析均表明斑子麻黄与木贼麻黄关系最近。根据相对速率检验结果，结合前人所建立的麻黄属rbcL基因进化速率估计斑子麻黄与木贼麻黄的分歧时间约为10.85±2.44Mya。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 中国地胆草属研究概况
• 1.1.1 植物学描述
• 1.1.2 药用历史
• 1.1.3 化学成分和药理活性
• 1.2 药用植物次生代谢产物及其作用
• 1.2.1 植物精油研究及其意义
• 1.2.2 植物精油的应用
• 1.3 遗传多样性与分子进化分析方法
• 1.3.1 遗传多样性研究
• 1.3.2 分子系统发育与进化分析
• 1.3.3 遗传多态性和进化研究
• 1.4 本研究的目的
• 第2章 地胆草和白花地胆草的遗传多样性及居群结构
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 植物材料的采集与鉴定
• 2.2.2 研究地区概况
• 2.2.3 植物总DNA的提取、纯化及浓度测定
• 2.2.4 ISSR实验
• 2.2.5 基于ISSR数据的遗传多样性分析
• 2.2.6 相关性分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 地胆草ISSR分析
• 2.3.2 白花地胆草ISSR分析
• 2.3.3 相关性分析
• 2.4 讨论
• 第3章 地胆草和白花地胆草精油的化学成分分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 植物材料
• 3.2.2 试剂、仪器及其来源
• 3.2.3 精油化学成分测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 精油的化学成分
• 3.3.2 精油居群变异分析
• 3.3.3 精油成分与地理分布的相关性分析
• 3.3.4 精油成分与遗传结构的相关性分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 精油化学成分在实际中的应用
• 3.4.2 精油化学成分可以反映种下变异吗?
• 第4章 系统发育与进化分析方法及其应用
• 4.1 引言
• 4.2 基于遗传多样性数据的系统树构建方法
• 4.2.1 现有软件介绍
• 4.2.2 基于二元数据的构树软件编译
• 4.3 泛素与类泛素超家族的进化分析
• 4.3.1 泛素及其研究意义
• 4.3.2 泛素与类泛素超家族进化研究
• 4.4 系统发育分析方法在麻黄进化研究中的应用
• 4.4.1 麻黄进化研究中涉及的系统发育方法
• 4.4.2 结果与讨论
• 参考文献
• 附录1 攻读博士学位期间发表的论文
• 附录2 UBC Primer Set #9（Microsatellite）
• 附录3 基于二元数据构树软件源代码
• 附录4 博士论文相关的论文全文
• 致谢