马立克氏病病毒野毒株GX0101及其基因敲除株BAC克隆生物学活性的比较研究

论文摘要

马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）是α类疱疹病毒,其基因组为174kb的双股DNA。对于未经免疫的鸡群,有很高的传染性和致肿瘤性。鸡在感染MDV后除了造成死亡外,耐过鸡可终身带毒并长期排毒。因而,在鸡场里和周围环境中该病毒长期存在。禽网状内皮增生症病毒（Reticuloendotheliosis,REV）是一类C型反转录病毒,基因组是8kb的单股正链RNA,其基因组结构类似于一个完整的转座子,这是鸡的另一种致肿瘤病毒。张志等（2004）等首次从患鸡的抗凝血中分离到整合进REV-LTR片段的天然MDV野毒株GX0101和GD0202,这表明在自然感染的条件下,REV除了能与MDV共感染同一只家禽外,还能整合到MDV的基因组中,本研究将进一步阐明MDV这种重组野毒株致病性是否发生变化,特别是这种重组作用是否会增强MDV的传染性或在体内的复制能力,外源片段的的插入对病毒的致病性,特别是其生物学特性产生了怎样的影响。在以上背景下,本研究比较了天然重组野毒株GX0101对鸡的致病性,并将其构建成感染性细菌人工染色体。在此基础上将插入片段REV-LTR敲除再进一步研究其生物学特性。同时,对MDV的两个致瘤基因1.8kb mRNA及ICP4基因进行了相关研究。不仅积累了大量的数据而且提出并验证了新的观点。1天然重组野毒株GX0101的致病性研究分别选用海蓝褐公鸡和SPF鸡进行GX0101毒株的致病性测定。1日龄免疫HVT疫苗后于5日龄分别接种野毒株GX0101及超强毒株rMd5,每天观察记录死亡并逐只剖检记录发生肿瘤情况。试验结果显示,GX0101株病毒对海蓝褐公鸡的生长抑制作用要比rMd5株弱。而且GX0101株病毒对已经有HVT疫苗免疫的海蓝褐公鸡的致死率只有44%要显著低于rMd5株的70%（P<0.01）,而且它的致肿瘤率只有16%显著低于rMd5株的36%（P<0.05）, GX0101株病毒对已免有HVT疫苗的SPF鸡的致死率只有28.24%要显著低于rMd5株的64.63%（P<0.01）,而且它的致肿瘤率只有7.06%显著低于rMd5株的19.51%（P<0.05）,该结果表明GX0101株病毒的致病性要低于强毒株rMd5株。张志（2004）和庄国庆（2006）分别在SPF鸡中做了人工感染试验,结果显示GX0101毒株的致病性要强于强毒株GA株。因此,GX0101株的致病性应是介于强毒GA与超强毒rMd5间的一株病毒。由此看来,GX0101的致病性并不是使其成为流行毒株的竞争优势。2带有REV-LTR片段的MDV野毒株GX0101的BAC感染性克隆的构建及其致病性比较2.1带有MDV基因组US2片段作为同源臂的转基因BAC载体的构建MDV的US2区两侧的同源臂用于同源重组时将BAC载体插入MDV基因组,其中2.1kb的同源臂来自质粒pDS-pHAI,4.0kb同源臂来自质粒pUS2-Partial-F,通过限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ的双酶切作用,及T4DNA Ligation连接,成功构建重组转基因载体质粒pDS-pHAI-US2。2.2 GX0101 BAC感染性克隆的构建及其拯救利用磷酸钙或脂质体转染技术,将转移载体pDSpHAI-US2与MDV GX0101感染CEF细胞的总DNA共感染鸡胚成纤维细胞。待出现细胞病变时,将其传至已加有霉酚酸-黄嘌呤-次黄嘌呤选择培养基的原代CEF上,经四轮筛选、富集重组病毒后,提取重组病毒感染CEF细胞的总DNA,电转化大肠杆菌DH10B。次日,挑取阳性克隆。经酶切及PCR鉴定后,提取BAC DNA转染CEF细胞,再次启动了病毒感染,产生了MDV特异性病毒蚀斑,拯救出了重组病毒;进一步研究表明重组病毒bac-GX0101与亲本毒GX0101在体外CEF单层上的生物学特性相似。2.3 GX0101感染性克隆的致病性比较将BAC克隆毒bac-GX0101与亲本毒GX0101接种1日龄SPF鸡,动物实验结果表明bac-GX0101毒株与亲本GX0101毒株对机体的生长性能等方面的影响没有差异,而且bac-GX0101毒株仍然保留着很好的免疫抑制功能及致肿瘤能力。该感染性克隆bac-GX0101为研究该重组野毒株中REV-LTR插入片段及其他基因的生物学功能提供了有用的技术平台。3敲除REV-LTR的感染性克隆的构建及其生物学特性比较3. 1 MDV天然重组野毒株GX0101中LTR序列的敲除MDV和REV间的自然重组的机率是很低的,在我们近几年分离到的十多个野毒株中,却有两个是重组病毒,说明这一重组过程一定有某种选择竞争性优势。为了阐明天然重组插入的REV-LTR究竟能给原始的MDV带来什么生物学特性变化,对基因组做相应的突变是必经的步骤。将GX0101构建成感染性细菌人工染色体,由于我们可以比较方便地对感染性克隆质粒GX0101-BAC基因组进行修饰,如定点敲除重组野毒株中某个基因或基因片段。这就可以用其作为研究该株MDV的特定基因或基因片段与致病性或其他生物学活性关系的一个新的技术平台。本研究利用Red/ET介导的突变技术,用卡那霉素抗性基因代替要敲除的LTR序列。设计引物,以质粒PKD13为模板,扩增卡那霉素抗性基因。这对引物3’端20个碱基来源于卡那霉素抗性基因,用来扩增该抗性基因,5’端50个碱基来源于MDV,用来同源重组,上下游引物5’端的这50个碱基来源于MDV基因组,分别位于要敲除的LTR序列的两端。卡那霉素抗性基因两端FRT位点是重组酶Flpe的识别位点。卡那霉素抗性基因取代LTR序列后,用0.1%的阿拉伯糖诱导表达Flpe重组酶,从而将卡那霉素抗性基因去除。利用脂质体转染技术,拯出重组病毒,命名为bac-GX0101△LTR。3.2整合进GX0101基因组中的REV-LTR序列的生物学特性研究在5日龄时,分别接种bac-GX0101及bac-GX0101△LTR于1日龄免疫HVT疫苗的SPF鸡,无论是bac-GX0101还是bac-GX0101△LTR,感染SPF鸡后,对生长性能和对NDV、AIV（H9-）灭活疫苗免疫后HI抗体反应均呈现出不同程度的抑制作用。相对而言,bac-GX0101△LTR对SPF鸡的致病作用低于bac-GX0101;斑点杂交检测羽毛囊中的MDV基因组DNA说明,与接种bac-GX0101毒株的同笼饲养的未攻毒鸡的MDV基因组的检出时间和接种bac-GX0101△LTR毒株的同笼饲养的未攻毒鸡的MDV基因组的检出时间相比要早一周,并且检出率也要高。接种bac-GX0101毒株和bac-GX0101△LTR毒株的鸡群在100天内的死亡率分别是28.13%和43.75%;出现肿瘤的比率是9.3%和12.5%。这充分说明REV-LTR的插入不是增强GX0101毒株的致病性和致肿瘤能力而是增强了GX0101毒株的横向传播能力,从而使GX0101毒株具有一定的竞争优势,成为流行毒株。4 MDV中1.8-kb mRNA基因的潜在阅读框A和C的敲除及其功能研究为了研究马立克氏病毒（MDV）1.8kb mRNA中潜在阅读框的功能,利用Red/ET技术将1.8kb mRNA中潜在阅读框（A+C）敲除,并成功转染出病毒bac-GX0101△（A+C）,同时将bac-GX0101△（A+C）与bac-GX0101分别感染CEF后,转染包含MDV上游双向启动子的质粒pP（pp38）-CAT和pP（1.8-kb）-CAT,48h后,通过测定转染细胞裂解液中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的活性确定MDV 1.8-kb mRNA中潜在阅读框对双向启动子活性的影响。结果显示,1.8kb mRNA中潜在阅读框（A+C）的缺失可以使其上游双向启动子两个方向的活性均显著下降（P<0.01）。本研究结果证明了1.8-kb mRNA对其上游双向启动子活性具有增强作用。将bac-GX0101△（A+C）和bac-GX0101毒株感染SPF鸡,动物试验结果表明,GX0101毒株缺失1.8kbmRNA后,对鸡群的增重影响较轻。且对NDV和AIV灭活疫苗免疫后HI抗体滴度均高于bac-GX0101感染组, bac-GX0101△（A+C）感染的鸡只肿瘤出现时间比bac-GX0101晚22d,说明仅仅敲掉开放阅读框A和C并不能消除其致瘤性。5 MDV中ICP4基因的敲除及其致病性比较本文利用Red/ET介导的突变技术,将ICP4基因敲除,拯救出重组病毒bac-GX0101△ICP4。分别将bac-GX0101△ICP4和bac-GX0101接种SPF鸡,动物试验结果表明,GX0101毒株缺失ICP4基因后,对NDV和AIV灭活疫苗免疫后HI抗体滴度低于对照组,且与bac-GX0101的差异不显著（P>0.05）,且鸡群在感染bac-GX0101△ICP4毒株后58d检测到内脏肿瘤,说明ICP4基因并不直接参与肿瘤的形成。

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1 文献综述

1.1 马立克氏病病毒（MDV）研究进展

1.1.1 病原学

1.1.2 流行病学

1.1.3 发病机理及病理变化

1.1.4 诊断技术

1.1.5 疾病防制策略

1.2 马立克氏病病毒的致病型

1.3 马立克氏病病毒的基因组结构

1.4 禽反转录病毒与DNA病毒间的基因重组

1.4.1 病毒的变异方式

1.4.2 MDV 与REV 间的基因重组

1.4.3 MDV 与ALV 间的基因重组

1.4.4 禽反转录病毒与DNA病毒间的基因重组的发生机制

1.5 不同病毒间遗传重组的流行病学意义

1.6 DNA 片段克隆的载体系统

1.6.1 质粒

1.6.2 粘粒

1.6.3 BAC 的优势及其发展

1.7 操纵MDV 基因：依靠细菌人工染色体新技术

1.7.1 RecA 蛋白介导的同源重组

1.7.2 RecE/T 蛋白介导的同源重组

1.8 本研究的意义

2 一株整合有 REV 长末端重复序列的 MDV 的致病性研究

2.1 材料和方法

2.1.1 材料

2.1.1.1 蛋鸡、SPF 鸡和SPF 动物设施

2.1.1.2 病毒与鸡胚

2.1.1.3 疫苗

2.1.1.4 主要仪器

2.1.2 方法

2.1.2.1 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备

2.1.2.2 病毒的增殖与定量

2.1.2.3 MDV 人工攻毒

2.1.2.4 NDV 和AIV 油乳灭活苗的免疫和免疫反应的测定

2.1.2.5 MDV 感染对体重的影响

2.1.2.6 接种 MDV 的海蓝褐公鸡的死亡率及肿瘤发生率

2.1.2.7 MDV 感染影响免疫器官发育的比较方法

2.1.2.8 病理学检测

2.1.2.9 统计学分析

2.2 结果

2.2.1 GX0101 毒株感染对鸡生长性能的影响

2.2.1.1 对海蓝褐公鸡的影响

2.2.1.2 对SPF 鸡的影响

2.2.2 GX0101 毒株感染对NDV 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用

2.2.2.1 对海蓝褐公鸡的影响

2.2.2.2 对SPF 鸡的影响

2.2.3 GX0101 毒株感染对 AIV-H5 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用

2.2.3.1 对海蓝褐公鸡的影响

2.2.3.2 对SPF 鸡的影响

2.2.4 GX0101 毒株感染对 AIV-H9 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用

2.2.4.1 对海蓝褐公鸡的影响

2.2.4.2 对SPF 鸡的影响

2.2.5 GX0101 毒株感染后对中枢免疫器官的影响

2.2.6 接种 MDV 的鸡的死亡率及肿瘤发生率

2.2.6.1 对海蓝褐公鸡的死亡率及肿瘤发生率

2.2.6.2 对SPF 鸡的死亡率及肿瘤发生率

2.3 讨论

3 带有 REV-LTR 片段的 MDV 野毒株 GX0101 的BAC 克隆的构建及拯救病毒的致病性分析

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.1.1 病毒

3.1.1.2 相关试剂

3.1.1.3 动物及疫苗

3.1.2 方法

3.1.2.1 构建感染性 BAC 分子克隆化病毒的技术路线

3.1.2.2 重组转基因载体质粒 pDS-pHAI-US2 的构建

3.1.2.3 GX0101-BAC 克隆的构建及鉴定

3.1.2.4 重组病毒的拯救及间接免疫荧光试验

3.1.2.5 BAC 克隆毒bac-GX0101 与亲本毒GX0101 致病性比较

3.2 结果与分析

3.2.1 质粒 pDS-pHAI-US2

3.2.2 GX0101-BAC 克隆的鉴定

3.2.3 拯救的重组病毒的鉴定

3.2.4 IFA 检测重组病毒bac-GX0101

3.2.5 对增重的影响

3.2.6 对 NDV 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用

3.2.7 对AIV-H5 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用

3.2.8 对AIV-H9 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用

3.2.9 致肿瘤性以及死亡率

3.2.10 GX0101、bac-GX0101 株感染对 SPF 鸡的病理组织学检测

3.3 讨论

4 马立克氏病病毒野毒株 GX0101 的 LTR 序列敲除及其生物学特性比较

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.1.1 细胞与病毒

4.1.1.2 相关试剂

4.1.1.3 动物及疫苗

4.1.2 方法

4.1.2.1 卡那霉素抗性基因的扩增

4.1.2.2 REV-LTR 序列的敲除

4.1.2.3 GX0101△LT R-BAC DNA 的鉴定

4.1.2.4 PCR产物序列的比较与分析

4.1.2.5 GX0101△LT R-BAC DNA 的提取

4.1.2.6 重组病毒的拯救

4.1.2.7 间接免疫荧光法（IFA）检测拯救的重组病毒bac-GX0101△LTR

4.1.2.8 MDV 毒人工感染方法

4.1.2.9 MDV 感染对体重的影响

4.1.2.10 对 NDV 和 AIV 油乳灭活苗的免疫后的免疫抑制性的比较

4.1.2.11 斑点杂交检测 bac-GX0101 毒株与 bac-GX0101△LTR 毒株的横向传播能力

4.1.2.12 病毒血症的检测

4.2 结果

4.2.1 卡那霉素的特异性扩增

4.2.2 敲除GX0101 株中整合的REV-LTR 序列

4.2.3 PCR 产物的序列测定与分析

4.2.4 拯救病毒 bac-GX0101△LTR

4.2.5 对增重的影响

4.2.6 对 NDV 疫苗免疫抗体反应的抑制作用

4.2.7 对 AIV-H9 疫苗免疫抗体反应的抑制作用

4.2.8 间接免疫荧光法（IFA）检测 MDV 病毒血症水平

4.2.9 MDV-pp38 核酸探针灵敏度及特异性检测

4.2.10 斑点分子杂交检测感染鸡的羽毛囊中的 MDV

4.2.11 bac-GX0101 毒株与bac-GX0101△LTR 毒株横向传播能力的比较

4.2.12 两株 MDV 诱发鸡的死亡率和肿瘤发生率比较

4.3 讨论

5 马立克氏病病毒 ICP4 基因功能的研究

5.1 材料与方法

5.1.1 材料

5.1.1.1 细胞与病毒

5.1.1.2 相关试剂

5.1.1.3 动物及疫苗

5.1.2 方法

5.1.2.1 卡那霉素抗性基因的扩增

5.1.2.2 ICP4 基因的敲除

5.1.2.3 GX0101 △ICP4 -BAC DNA 的鉴定

5.1.2.4 PCR 产物序列的比较与分析

5.1.2.5 GX0101△ICP4 -BAC DNA 的提取

5.1.2.6 重组病毒的拯救

5.1.2.7 间接免疫荧光法（IFA）检测拯救的重组病毒bac-GX0101△ICP4

5.1.2.8 bac-GX0101 △ICP4 与bac-GX0101 致病性比较

5.2 结果与分析

5.2.1 敲除MDV 毒株中的ICP4 基因

5.2.2 PCR 产物的序列测定与分析

5.2.3 拯救bac-GX0101△ICP4

5.2.4 IFA

5.2.5 对增重的影响

5.2.6 对 NDV 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用

5.2.7 对 AIV-H5 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用

5.2.8 对 AIV-H9 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用

5.2.9 致死率与致肿瘤性

5.3 讨论

6 马立克氏病毒1.8-kb mRNA 基因的潜在阅读框A和C的敲除及其功能研究

6.1 材料与方法

6.1.1 材料

6.1.1.1 病毒

6.1.1.2 相关试剂

6.1.1.3 动物及疫苗

6.1.2 方法

6.1.2.1 GX0101△（A+C） -BAC的构建

6.1.2.2 GX0101△（A+C） -BAC DNA 的鉴定

6.1.2.3 GX0101 △（A+C） -BAC DNA 拯救病毒生长特性的测定

6.1.2.4 ORF（A+C）对双向启动子活性的影响

6.1.2.5 bac-GX0101△（A+C）与bac-GX0101 致病性比较

6.2 结果

6.2.1 1.8kb-m RNA 中ORF（A+C）缺失株的构建

6.2.3 1.8kb-mRNA 中 ORF（A+C）对双向启动子活性的影响

6.2.4 对增重的影响

6.2.5 对 NDV 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用

6.2.6 对 AIV-H5 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用

6.2.7 对 AIV-H9 疫苗免疫后抗体反应的抑制作用

6.2.8 致肿瘤性

6.3 讨论

结论

创新之处

参考文献

致谢

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马立克氏病病毒野毒株GX0101及其基因敲除株BAC克隆生物学活性的比较研究

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