论文题目: 苎麻木质素合成关键酶CCoAOMT基因分离及遗传转化的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物遗传育种
作者: 陈建荣
导师: 郭清泉,张学文
关键词: 苎麻,木质素合成代谢,咖啡酰甲基转移酶基因,反义技术,高效表达,遗传转化
文献来源: 湖南农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 苎麻[Boehmeria nivea(Linn.)Gaud.]是我国重要的可再生纺织原料作物，具有较大经济利用价值。苎麻经长期的异花授粉导致遗传背景非常复杂，自然和人工选择导致部分性状(基因)的丢失，遗传学与分子生物学研究基础十分薄弱。利用传统育种的方法改良纤维品质虽已取得较大成功，但仍有一些无法解决的问题，例如降低木质素含量便难以通过常规育种来实现。通过栽培或生产措施来控制木质素含量可操作性不强。通过基因工程技术改良苎麻品质进行低木质素育种，降低木质素的含量或改变其组分，将是苎麻遗传改良非常有前景的领域。本研究采用RT-PCR的方法，首次克隆了苎麻内源的CCoAOMT新基因，分析苎麻CCoAOMT基因序列，分别构建了苎麻和烟草的反义CCoAOMT基因表达载体，并通过农杆菌介导进行遗传转化的探索。本文的主要研究结果如下：(1)改良并建立了采用TRIZOL试剂提取高质量总RNA的方法，优化RT-PCR扩增反应条件和RACE反应技术路线，为从富含多酚和多糖等多种次生代谢物质的植物中分离高质量总RNA，通过逆转录技术克隆目的基因提供了科学、简便、实用的方法。(2)首次克隆了苎麻植物中的咖啡酰CoA甲基转移酶新基因全长cDNA序列，并登录GenBank，获得登录号为AY651026。在线进行保守区域分析，结果表明苎麻咖啡酰辅酶A甲基转移酶是氧甲基转移酶类。在3种水平即基因包括3’UTR、5’UTR和编码区序列的mRNA序列、mRNA编码区序列以及氨基酸序列进行比对，并构建系统发生树。分析结果显示，苎麻(Boehmeria nivea)的CCoAOMT基因包括3’UTR、5’UTR和编码区序列的mRNA序列与已报道的其他植物的相应序列不能聚为一类，其差异明显大于其他植物间的差异。苎麻(Boehmeria nivea)的CCoAOMT基因mRNA编码区序列(AY651026)与玉米(Zea mays：ZMA242980、ZMA242981)的同源性高于其他植物。苎麻(Boehmeria nivea)CCoAOMT酶蛋白氨基酸序列(AY651026)与杨树(Populus balsamifera：AJ224894、AJ224896)、美洲山杨(Populus tremuloides：PTU27116)的同源性高于其他植物。(3)采用蛋白质表达系统构建了苎麻CCoAOMT cDNA编码区的高效表达载体pQE-30-BNCCOAOMT，在大肠杆菌中高效表达了苎麻咖啡酰CoA甲基转移酶蛋白，得到目的蛋白质分子量为29.4 kD。(4)首次克隆了苎麻四个栽培品种CCoAOMT基因基因组序列，分别登录GenBank，并获得登录号为：AY818191(湘苎3号)、AY822619(圆麻)、AY822620(芦竹青)和AY822622(青麻)。序列分析结果表明，在苎麻4个栽培品种的CCoAOMT基因的基因组DNA片段序列，序列长度不同，各含有3个内含子，内含子序列有差异。在DNA的编码区，仅有5个碱基位点具有多态性。对苎麻4个栽培品种进行DNA序列同源性和进化树分析，序列间比对分值表明4个栽培品种之间同源性在96％以上。(5)克隆的烟草CCoAOMT基因包含了整个读码框序列的长度为862bp的全长cDNA序列，与烟草CCoAOMT-2基因mRNA全长CDS(GenBank登录号U62734)同源性为98％。(6)构建了烟草CCoAOMT基因反义表达载体pBI121-antiNTCCoAOMT，获得工程农杆菌LBA4404(pBI121-anti NTCCoAOMT)。构建了苎麻CCoAOMT基因反义表达载体pBI121-antiBNCCoAOMT，获得工程农杆菌LBA4404(pBI121-antiNTCCoAOMT)，用于对植物的遗传转化。(7)建立了一套苎麻叶片外植体再生体系。确定了对苎麻转化体和非转化体进行筛选的Kan浓度为25 mg／L。建立了程序化的农杆菌介导苎麻叶片遗传转化的体系。(8)通过工程农杆菌介导烟草反义CCoAOMT基因表达载体(pBI121-anti NTCCoAOMT)转化苎麻，PCR检测结果初步证明苎麻转基因小植株已经获得外源基因。通过工程农杆菌介导苎麻反义CCoAOMT基因表达载体(pBI121-anti BNCCoAOMT)转化苎麻叶片，获得抗性愈伤组织。通过工程农杆菌介导苎麻反义CCoAOMT基因表达载体(pBI121-antiBNCCoAOMT)转化模式植物烟草W38，获得了抗性植株。上述研究结果为深入研究苎麻内源的CCoAOMT基因及其编码蛋白在苎麻木质素代谢中的功能提供了理论与实验依据。为最终获得木质素含量下降或组分改良的转基因苎麻，创造适合我国国情环保型低木质素苎麻转基因新品种奠定了基础。
论文目录:
中文摘要
ABSTRACT
缩写词
目录
第一章 绪论
1 木质素生物合成的研究进展
1.1 木质素的组成
1.2 木质素的生物合成
1.3 木质素合成的分子调控
2 反义RNA技术在植物基因工程中的应用
2.1 反义RNA技术的操作原理
2.2 反义RNA技术在植物基因工程中的应用
2.3 反义RNA技术的特点和展望
3 研究的目的意义
第二章 苎麻咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因克隆与生物信息学分析
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
1.1.2 菌种
1.1.3 主要试剂
1.2 方法
1.2.1 苎麻总RNA的分离
1.2.2 苎麻CCoAOMT基因cDNA核心序列的克隆
1.2.3 苎麻CCoAOMT基因全长cDNA序列的克隆
1.2.4 苎麻CCoAOMT基因组序列的克隆
1.2.5 在大肠杆菌中高效表达苎麻CCoAOMT cDNA编码区
2 结果与分析
2.1 苎麻总RNA的分离
2.2 苎麻CCoAOMT基因cDNA核心序列的克隆与测序
2.2.1 RT-PCR扩增反应条件优化
2.2.2 RT-PCR扩增产物阳性克隆的筛选与鉴定
2.3 苎麻CCoAOMT基因全长cDNA序列的克隆与测序
2.3.1 cDNA末端的克隆
2.3.2 cDNA末端扩增产物测序及核苷酸序列生物信息学分析
2.4 苎麻CCoAOMT基因基因组DNA片段的克隆与序列分析
2.4.1 PCR扩增反应条件优化
2.4.2 PCR扩增产物T载体连接及阳性克隆的筛选与鉴定
2.4.3 苎麻CCoAOMT基因基因组DNA片段的序列分析
2.5 苎麻CCoAOMT cDNA编码区在大肠杆菌中的高效表达
2.5.1 高效表达载体的构建的验证
2.5.2 大肠杆菌中苎麻CCoAOMT cDNA编码蛋白的诱导表达
3 讨论
3.1 苎麻总RNA的分离成功的关键
3.2 采用简并引物需要反复实验
3.3 关于序列比较与分子进化分析方法
第三章 烟草CCoAOMT基因克隆与反义表达载体的构建
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
1.1.2 菌种与质粒
1.1.3 主要试剂
1.2 方法
1.2.1 烟草总RNA的分离
1.2.2 烟草CCoAOMT基因全长cDNA的克隆
1.2.3 烟草CCoAOMT基因反义表达载体的构建
1.2.4 反义表达载体直接转化转化根癌农杆菌
2 结果与分析
2.1 烟草CCoAOMT基因全长cDNA的克隆与序列分析
2.2 烟草CCoAOMT基因反义表达载体的构建与验证
2.3 工程根癌农杆菌LBA4404(pBI121-antiNTCCoAOMT)的验证
3 讨论
第四章 苎麻反义CCoAOMT基因表达载体的构建和遗传转化的研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
1.1.2 菌种
1.1.3 主要试剂
1.2 方法
1.2.1 苎麻反义CCoAOMT基因表达载体的构建
1.2.2 苎麻CCoAOMT基因反义表达载体直接转化根癌农杆菌
1.2.3 苎麻叶片再生植株体系的建立
1.2.4 苎麻对Kan的耐受性实验
1.2.5 农杆菌介导苎麻叶片转基因操作体系的优化
1.2.6 工程农杆菌介导反义CCoAOMT基因遗传转化的研究
2 结果与分析
2.1 苎麻CCoAOMT基因反义表达载体的构建
2.2 苎麻反义CCoAOMT基因表达载体转化工程根癌农杆菌
2.3 苎麻叶片愈伤组织的诱导和叶片直接分化芽体系的建立
2.4 转基因苎麻合适的筛选压力Kan浓度的确定
2.5 建立农杆菌介导苎麻叶片转基因操作体系
2.6 工程农杆菌介导反义CCoAOMT基因表达载体遗传转化
3 讨论
第五章 结论
1 主要研究结果
2 主要创新之处
3 今后的研究方向与目标
参考文献
附录1 测序报告
附录2 GenBank登录序列
致谢
在读期间的主要成果
作者简介
发布时间: 2007-12-06
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