论文摘要
慢性牙周炎是牙周组织的慢性感染性疾病,其特点是牙周组织破坏,牙周袋形成、牙槽骨吸收,最终导致牙齿丧失。大量证据表明牙菌斑生物膜中的革兰氏阴性菌如牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌等是引起牙周炎的始动因子。这些牙周致病菌在龈下环境中定植、繁殖,产生内毒素、蛋白酶等毒性物质直接破坏牙周组织;同时还可引发一系列的宿主免疫反应,产生大量炎性介质,间接导致牙周结缔组织破坏、牙槽骨吸收。中间普氏菌是革兰氏阴性产黑色素专性厌养杆菌,该菌与急性坏死性溃疡性牙龈炎、慢性牙周炎、牙周脓肿以及妊娠性牙龈炎的发病密切相关。此外,中间普氏菌还是坏疽性口炎以及肺部感染的重要致病菌,其主要致病因子包括脂多糖、凝集素、纤毛、囊泡、蛋白水解酶等。铁是微生物生存和繁殖所必不可少的一种营养元素,铁参与多种生物过程:如光合作用、呼吸作用、氧的转运、基因调控以及DNA生物合成等。在宿主内,由于铁被包含于血黄素、血红素结合蛋白、以及含血红素的蛋白（血红蛋白和肌红蛋白）细胞内,或被转铁蛋白和乳铁蛋白结合;此外,游离的血红素又迅速被血液结合素和白蛋白结合,使得游离铁浓度极低,约为10-18μM,远低于细菌生长繁殖所需要的0.05-0.5μM。因此,细菌能否从铁受限的环境中摄取足够的铁以维持其生长繁殖是其重要的毒力因子。铁是中间普氏菌的必需营养素,但由于该菌不能合成血红素,因此必须从宿主内摄取铁以维持其生长。迄今为止,对该菌的铁摄取机制以及铁对其病原性影响的研究甚少。有研究发现,牙周炎部位龈沟液内的铁含量明显高于正常或龈炎部位龈沟液中的铁含量,有学者认为龈沟液内主要的铁源可能是红细胞溶解所释放的血红蛋白（hemoglobin, Hb）。中间普氏菌释放大量的凝血及溶血因子,可使红细胞凝集、溶解、Hb释放。近期有研究报道Hb作为唯一的铁源可以促进该菌的增殖,但对于该菌从Hb摄取铁的机制尚无研究报道。因此本研究将就中间普氏菌利用Hb铁的可能机制进行探讨。细菌在体内的生长繁殖是其致病的首要条件,但细菌所引发的一系列宿主反应是导致组织破坏的主要因素。牙周炎时,宿主细胞所产生的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）和其他蛋白酶在牙周组织的破坏中起重要作用。MMP是一组锌和钙依赖性蛋白酶,可降解细胞外基质（extracellular matrix, ECM）和基底膜成分。MMP广泛参与各种生理功能,如形态发生、组织改建、创伤愈合、宿主防御和免疫调控等。在病理性疾病如肿瘤、类风湿性关节炎和慢性牙周炎的发病中也起重要作用。大量研究表明,与牙周健康部位相比,牙周炎部位的龈沟液以及牙周组织中多种MMP水平明显升高,提示MMP与牙周炎密切相关。目前关于牙周膜成纤维细胞的研究相对较少。牙周膜成纤维细胞不仅在牙周膜的形成和维持中起重要作用,也在相邻组织牙槽骨和牙骨质的修复、重建和再生中起重要作用。研究发现中间普氏菌可诱导人牙龈上皮细胞和牙周膜细胞表达炎性细胞因子,但关于中间普氏菌对MMP表达调控作用的研究甚少,迄今尚无中间普氏菌对牙周组织细胞MMP调控作用的研究报道,因此本研究将就中间普氏菌对人牙周膜细胞（human periodontalligament cells, hPDLc）分泌MMP的作用进行探讨,同时探讨丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）信号系统在中间普氏菌诱导的MMP表达中的调控作用,以期揭示中间普氏菌在牙周炎发生中的致病机制。本研究的主要结果如下:1.中间普氏菌对Hb的利用及其铁摄取机制1.1利用细菌培养方法,证实中间普氏菌可有效利用Hb作为其铁源。斑点印迹结果显示,中间普氏菌细胞可与Hb结合,两者的结合受pH影响,在弱酸性环境中的结合强度高于弱碱性环境。pH5.0时,中间普氏菌与Hb的结合能力最强。1.2利用batch亲和层析和SDS-PAGE方法鉴定出与Hb结合的中间普氏菌外膜蛋白。通过综合运用阴离子层析、Hb凝胶亲和层析和羟基磷灰石层析等蛋白质纯化技术,纯化出与Hb结合的60kDa外膜蛋白。1.3 60 kDa血红蛋白结合蛋白（hemoglobin-binding protein, HBP）与Hb的结合受pH影响, pH5.0时,HBP与Hb的结合能力最强。表面等离子共振技术对HBP和Hb相互作用的实时监测结果表明,两者之间的的解离系数为1.48×10-8 M,提示HBP特异性与Hb结合。1.4抑制性研究结果表明珠蛋白可显著抑制HBP与Hb的结合,而血红素、过氧化氢酶以及细胞色素C对两者的结合没有影响,提示Hb的珠蛋白结构域而非血红素结构域参与了HBP与Hb的结合。1.5由于HBP的氨基端被封闭,未能够测出HBP氨基端的氨基酸序列。利用凝胶内消化和逆相HPLC技术将HBP分离为肽片段,测定了数个肽片段的氨基酸序列。将所得到的氨基酸序列进行检索,未发现这些序列与已知的HBP具有同源性,提示中间普氏菌HBP可能为新发现的一种HBP。1.6铁的限制对HBP的表达无明显影响,提示HBP为组成性表达的蛋白;铁限制对中间普氏菌与Hb的结合能力也无明显影响。1.7利用SDS-PAGE技术检测中间普氏菌对Hb的降解并利用扫描密度仪对降解作用进行定量分析,发现中间普氏菌对Hb的降解具有时间依赖效应且该降解作用受pH影响,pH5.0时降解作用最强。抑制性研究结果发现参与Hb降解的可能是一种半胱氨酸蛋白酶。铁的限制对中间普氏菌的Hb降解作用没有影响,提示该半胱氨酸蛋白酶为组成性表达。2.中间普氏菌对hPDLc MMP表达的调控作用2.1 RT-PCR结果显示,hPDLc组成性表达MMP-1、-2、-3、-14、TIMP-1和TIMP-2。中间普氏菌培养上清刺激hPDLc 6 h后,可诱导MMP-9、上调MMP-1和TIMP-1、下调TIMP-2 mRNA的表达,对其他MMP mRNA表达无影响。2.2明胶酶谱结果显示,中间普氏菌培养上清可浓度依赖性地诱导hPDLc分泌MMP-9,该诱导作用具有时间依赖效应;但对MMP-2的分泌无调控作用。2.3利用ELISA技术检测了其他MMP的分泌,发现中间普氏菌培养上清可浓度依赖性地增强MMP-1和TIMP-1的分泌、降低TIMP-2的分泌,该作用具有时间效应。对MMP-3的分泌无影响。2.4 MAPK信号通路在在中间普氏菌诱导的MMP分泌中起不同调控作用:ERK、JNK和p38抑制剂对中间普氏菌诱导的MMP-9分泌无任何调控作用;ERK、JNK和p38抑制剂显著抑制中间普氏菌对MMP-1的促分泌作用;ERK和JNK抑制剂显著抑制中间普氏菌对TIMP-1的促分泌作用,但p38抑制剂对中间普氏菌的促TIMP分泌作用无抑制效果;JNK和p38抑制剂逆转了中间普氏菌对TIMP-2的抑制作用;所有MAPK抑制剂均对MMP-3的分泌无明显影响。结论中间普氏菌可有效利用Hb作为其铁源,该菌从Hb摄取铁的可能机制是:首先细胞外膜的60kDa HBP与Hb特异性结合,然后结合的Hb被该菌产生的半胱氨酸蛋白酶降解,从而使包含于Hb内的血红素释放以供其利用。有效的铁摄取机制保障了中间普氏菌在体内的定植和繁殖。中间普氏菌可诱导hPDLc表达并分泌MMP-9,促进hPDLc表达并分泌MMP-1和TIMP-1,抑制hPDLc分泌TIMP-2。中间普氏菌通过其对MMP表达的广泛调控而参与牙周结缔组织的降解和破坏,从而在慢性牙周炎的发生发展中起一定作用。
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