论文摘要
目的:观察局部亚低温对大鼠全脑缺血/再灌注损伤的保护作用,探讨局部亚低温激活线粒体ATP敏感性钾通道及其脑保护的可能机制。方法1实验分组及动物模型制备雄性健康SD大鼠32只,月龄2～3月,体重200～250g（河北医科大学实验动物中心提供）。随机分为4组（n=8）:假手术组（S组）:暴露双侧颈总动脉和基底动脉,基底动脉仅穿线不阻断,维持正常体温（36.5～37.5℃）,观察12小时;缺血/再灌注组（I/R组）:暴露双侧颈总动脉和基底动脉,双侧颈总动脉动脉夹夹闭,基底动脉穿线并阻断,缺血10 min,再灌12小时,维持正常体温（36.5～37.5℃）;亚低温组（H组）:暴露双侧颈总动脉和基底动脉,双侧颈总动脉动脉夹夹闭,基底动脉穿线并阻断,缺血10 min,再灌12小时,再灌注前即刻经股静脉输注3.5 ml 10℃生理盐水,结合冰袋冷敷头部,采用60 W白炽灯泡距离大鼠37 cm高度直接照射身体,通过调节灯至身体的距离及头部冰块的数量来调节,使鼓膜温度在1 min内降至32～34℃,肛温在20 min内恢复并维持于正常体温（36.5～37.5℃）,头部低温维持3小时,自然复温;5-羟基葵酸钠组（5-HD组）:缺血前30 min,腹腔注射1 mg/ml的5-羟基葵酸钠10 mg/kg ,余处理同H组。其它三组于缺血前30 min,腹腔内注射等容积生理盐水。全脑缺血/再灌注模型制备:采用三血管阻断法。2检测指标及检测方法2.1.1各组动物体重,月龄。2.1.2各组动物脑缺血前5 min （T1）、脑缺血10 min （T2）、再灌注后10 min （T3）分别采集股动脉血监测血气指标。2.2神经行为学评分再灌注12小时分别进行神经行为学评估。格子爬行实验（OFT）:将动物置于分析箱的正中方格中,观察5 min内动物的跨格次数（三爪以上跨入邻格）,分析箱大小为1 m×1 m×0.4 m,箱底分为25个方格（20 cm×20 cm）。斜板实验（IPT）:将大鼠按头向下的方向置于45度倾斜的木板上,记录大鼠本能的转体为头向上所需的时间。2.3脑组织匀浆超氧化歧化酶（SOD）活性缺血/再灌注12小时,水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,断头处死大鼠。在冰盘上迅速取出右侧大脑半球,置于-20℃冰箱保存备用。采用黄嘌呤氧化酶法测定脑组织匀浆SOD活性。2.4脑组织匀浆丙二醛（MDA）浓度缺血/再灌注12小时,水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,断头处死大鼠。在冰皿上迅速取出右侧大脑半球,置于-20℃冰箱保存备用。采用硫代巴比妥酸法测定脑组织匀浆MDA浓度。2.5脑水含量缺血/再灌注12小时,水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,断头处死大鼠后,在冰盘上迅速取出脑组织取左侧大脑半球,滤纸吸干表面水份,置于干燥小瓶中-20℃保存。用干（110℃,24小时烘干）、湿重法计算脑水含量,作为脑水肿程度的判断标准。2.6血清神经元特异性烯醇化酶（NSE）的浓度缺血/再灌注12小时,水合氯醛腹腔注射,麻醉后取颈内静脉血1 ml,37.5℃恒温水箱中水浴30 min后,以半径8 cm、以转速3500 r/min离心10 min,取血清,置于液氮罐中保存备用。采用Elisia法测定血清NSE的浓度。2.7光镜下观察脑神经元病理学改变水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,断头处死大鼠后,取右侧大脑半球额叶皮质组织,冰盘上切取厚度为3 mm组织块,面积5 mm×5 mm,冷盐水冲洗干净后,置于4%多聚甲醛中摇匀,室温下过夜,在10×40光镜下观察皮质神经元的病理学改变。2.8电子显微镜观察脑神经元超微结构变化断头处死大鼠后,在冰盘上迅速取出脑组织,取右侧大脑半球额叶皮质组织,按照“快、小、轻、准”四字原则取材,将大小约1 mm×1 mm×1 mm脑组织致于4%戊二醛中固定,4℃冰箱中保存,固定1小时以上,送电镜实验室,在透射电镜下观察皮质神经元的超微结构。结果1.1各组动物体重、月龄,差异均无统计学意义（P>0.05）。1.2在脑缺血前5 min （T1）、脑缺血10 min （T2）、再灌注后10 min（T3）血气指标差异均无统计学意义（P>0.05）。2神经行为学评分OFT试验:与S组比较,I/R组、5-HD组大鼠爬格子数减少（P<0.05）;与S组比较,H组爬格子数,差异无统计学意义（P>0.05）;与I/R组比较,S组、H组爬格子数增多（P<0.05）;与5-HD组比较,S组、H组爬格子数增多（P<0.05）;与5-HD组比较,I/R组爬格子数,差异无统计学意义（P>0.05）。IPT试验:与S组比较,I/R组、5-HD组头转向时间增加（P<0.05）;与S组比较,H组头转向时间,差异无统计学意义（P>0.05） ;与I/R组比较,S组、H组大鼠头转向时间减少（P<0.05）;与5-HD组比较,S组、H组头转向时间增加（P<0.05）,I/R组头转向时间,差异无统计学意义（P>0.05）。3脑组织匀浆超氧化歧化酶（SOD）活性变化I/R组、H组、5-HD组与S组相比较,脑组织匀浆SOD活性降低（P<0.05）;与S组比较,I/R组脑组织匀浆SOD活性降低（P<0.05）,与I/R组比较,H组脑组织匀浆SOD活性升高（P<0.05）,与I/R组比较,5-HD组脑组织匀浆SOD活性,差异无统计学意义（P>0.05）。与S组和H组比较,5-HD组脑组织匀浆SOD活性下降（P<0.05）。4脑组织匀浆丙二醛（MDA）浓度变化I/R组、H组、5-HD组与S组相比较,脑组织匀浆MDA活性升高（P<0.05）;与S组比较,I/R组脑组织匀浆MDA活性升高（P<0.05）,与I/R组比较,H组脑组织匀浆MDA活性降低（P<0.05）,与I/R组比较,5-HD组差异无统计学意义（P>0.05）。与S组和H组比较,5-HD组脑组织匀浆MDA浓度升高（P<0.05）。5脑水含量的测定与S组相比较,I/R组、5-HD组脑含水量增加（P<0.05）;与S组比较,H组差异无统计学意义（P>0.05）;与I/R组比较,H组脑含水量降低（P<0.05）;与5-HD组比较,H组脑含水量降低（P<0.05）,I/R组差异无统计学意义（P>0.05）。6血清神经元特异性烯醇化酶（NSE）的浓度值与S组相比较,I/R组、5-HD组大鼠血清NSE的浓度升高（ P<0.05）;与S组比较,H组差异无统计学意义（ P>0.05）;与I/R组比较,H组大鼠血清NSE的浓度降低（P<0.05）;与5-HD组比较,H组血清NSE的浓度降低（P<0.05）,I/R组差异无统计学意义（P>0.05）。7光镜下观察神经元病理学改变S组神经细胞形态结构基本正常,胞浆丰富、均匀淡染,核圆形或椭圆形,核仁清楚。I/R组大部分神经细胞固缩,损伤范围扩大,嗜伊红性,尼氏体分解或消失,核浆分界不清,核仁不清。H组部分神经细胞轻度固缩,结构基本正常,核椭圆形,核仁清楚。5-HD组部分神经细胞固缩,损伤范围扩大,嗜伊红性,尼氏体分解或消失,核浆分界不清,核仁不清。H组较I/R组和5-HD组损伤轻,I/R组和5-HD组较S组损伤重。8电子显微镜观察脑神经元超微结构变化S组神经元形结构基本正常的,细胞核和细胞膜稍水肿,细胞器完整,数量无减少;线粒体极少部分嵴和膜融合或消失,粗面内质网轻度脱颗粒现象,高尔基复合体基本正常,可见次级溶酶体。I/R组神经元细胞质高度水肿,细胞器数量显著减少,核质也中度水肿;细胞质高度水肿,线粒体部分或大部分嵴和膜融合或消失,粗面内质网脱颗粒现象严重,部分双层核膜和细胞膜融合或消失,次级溶酶体核膜融合（不典型高尔基复合体）。H组神经元结构基本正常的,细胞质有极轻度水肿,局部轻度水肿;线粒体部分嵴融合或消失,粗面内质网轻度脱颗粒现象,高尔基复合体扁平囊轻度扩张,可见次级溶酶体。5-HD组细胞质、核质明显水肿;细胞质明显水肿,细胞器数量明显减少,线粒体大部分或全部嵴、部分或大部分膜融合或消失,粗面内质网脱颗粒现象严重,细胞质高度水肿,次级溶酶体数量显著减少。H组神经元超微结构较I/R组和5-HD组损伤减轻,但与S组比较神经元损伤加重,5-HD组与I/R组比较损伤程度基本相同。结论局部亚低温对全脑缺血/再灌注损伤大鼠的脑组织有保护作用,激活线粒体ATP敏感性钾通道是局部亚低温保护全脑缺血/再灌注损伤大鼠脑组织的机制之一。
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