猪牛杀菌/通透性增加蛋白N端cDNA的克隆和原核表达

论文摘要

杀菌/通透性增强蛋白（bactericidal/permeability-increasing protein,BPI）是嗜中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils,PMNs）分泌的一种阳离子抗菌糖蛋白,具有选择性杀伤革兰氏阴性细菌（gram-negative bacterial,G-）和中和内毒素等功能。研究发现BPI的N端片段具有与BPI同等的功能。目前,BPI已被认为是极有发展前途的新一代高效杀菌、中和内毒素的药物蛋白。为探讨猪、牛BPI N端片段的功能、研制防治G-感染的重组BPI生物制剂,本研究以长白猪和荷斯坦奶牛BPI为研究对象,运用分子克隆技术,分别对两种动物BPI的N端cDNA进行克隆和原核表达。试验内容与结果如下:1 BPI氮端cDNA的克隆与序列分析采用密度梯度离心法,分离出猪、牛PMNs。应用Trizol Reagent试剂盒从猪、牛嗜中性粒细胞抽提RNA。根据GenBank中已经登录的猪、牛BPI N端基因序列（猪:AF252874,牛:BC102310）,设计合成两对引物（猪P1:CGGAATTCATGACTTTGACCTGAGTGTGGAGGGC,P2:GCGTCGACTTACAGGCTGCTGCCGGACG;牛B1:CGGAATTCATGGCCAGAGGCCCTGAC,B2:GCGTCGACTCAAGGTGCCACCAGTGAGTAA）。在上游引物P1、B1的5′端设计了EcoRⅠ酶切位点,在下游引物P2、B2的5′端设计了SalⅠ酶切位点。运用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术,扩增获得了大小分别约为146bp和714bp的BPI N端片段。将纯化的扩增产物插入到克隆质粒pGEM-T-easy中,转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素（AMP）抗性筛选重组质粒。并将该阳性克隆质粒进行PCR鉴定和产物测序。PCR鉴定和产物测序结果说明重组质粒构建成功。测序结果显示:猪BPI N端cDNA序列与参考序列（AF252874）在第94位发生突变,牛BPI N端cDNA序列与参考序列（BC102310）在第503位发生突变;但氨基酸同源性均为100%。DNAstar软件对目的基因片段序列分析结果显示:猪BPI第2—146位与牛BPI第446—590位序列有81%的同源性,氨基酸序列的同源性达到了75%。2 BPI氮端cDNA的原核表达纯化扩增产物与pGEX-4T-1质粒分别经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,按3:1摩尔比进行连接,转化大肠杆菌BL21,AMP抗性筛选重组质粒。PCR鉴定和双酶切结果显示重组表达载体PGEX-BPIP和PGEX-BPIB构建成功。PGEX-BPIP和PGEX-BPIB分别导入大肠杆菌BL21菌中,在1mmol/L的IPTG诱导下高效表达。其中:猪融合蛋白分子量约为32kD（GST部分为26kD,BPIN端部分为6kD）;牛融合蛋白分子量约为52kD（GST部分为26kD,BPIN端部分为26kD）。经可溶性分析,重组的融合蛋白主要以包涵体的形式存在。包涵体经洗涤后,用十二烷基肌氨酸钠溶解液溶解包涵体。重组蛋白在低浓度PBS下透析复性后,经谷胱甘肽层析柱纯化后用SDS-PAGE蛋白电泳和紫外分光光度计检测蛋白的纯度和纯化的融合蛋白的浓度。得到猪、牛BPI氮端重组蛋白的浓度分别为0.028mg/ml和0.030mg/ml。本实验在国内首次成功克隆和表达了猪、牛BPI N端片段,为获取大量的BPI重组蛋白,深入研究其生物学功能及BPI的产业化奠定了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 文献综述
• 1 引言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 研究内容与技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 PMNs及其RNA的提取
• 3.2 RT-PCR法扩增BPI基因
• 3.3 重组克隆质粒的鉴定
• 3.4 BPI基因的序列测定
• 3.5 重组表达质粒的鉴定
• 3.6 重组表达质粒的诱导表达
• 3.7 重组蛋白的可溶性分析
• 3.8 重组蛋白的纯化
• 3.9 重组蛋白的浓度测定
• 4 讨论
• 4.1 引物设计
• 4.2 BPI基因的序列分析
• 4.3 原核表达载体的选择
• 4.4 包涵体的溶解和纯化
• 4.5 融合蛋白的复性
• 4.6 活性分析
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间发表论文