三氯乙烯诱导人皮肤角质形成细胞凋亡线粒体途径的初步研究

论文摘要

三氯乙烯（trichloroethylene,TCE）是一种有机溶剂,在工业上主要用做金属和电子元件的脱脂、清洗和去污。职业性皮肤接触TCE的工人中出现的严重皮肤损伤已经成为目前国内主要的职业卫生问题。但其皮肤损害的机理尚不清楚,限制了TCE引起的职业性皮肤损伤防治工作的开展。皮损的病理学特征以及体外试验研究结果均提示皮肤细胞特别是角质形成细胞（keratinocyte,KC）的异常凋亡在疾病的发生及发展中起到了重要作用,因此阐明TCE诱导KC凋亡的通路必将为进一步了解TCE对皮肤损害作用及其机制,并为TCE皮肤损害的防治提供参考依据。为此,本研究利用人KC体外测试方法,通过观察TCE诱导KC凋亡过程中caspase-3、caspase-9、caspase-8的活性、细胞凋亡水平变化和它们的相关性,以及银杏叶提取物（ginkgo biloba extract,EGb）的保护作用,初步探讨TCE引起KC凋亡的可能途径,并为皮肤损伤的防治提供基础资料。研究目的本研究通过观察TCE诱导体外培养的人原代KC凋亡过程中caspase-3,caspase-8,caspase-9活性变化以及细胞凋亡率改变,并观察caspase特异抑制剂的抑制作用及银杏叶提取物的保护作用,探讨三氯乙烯引起KC凋亡的可能途径,以期深入揭示TCE的皮肤细胞毒性机制,并为防治TCE皮肤损害和开发有效的防护用品提供理论依据。研究方法体外分离的人原代KC,用无血清培养基进行培养。分别给予不同浓度（0.125、0.25、0.5、1.0和2.0 mmol/L）的TCE处理,同时设培养基（空白）对照组;caspase-3 inhibitor、caspase-9 inhibitor抑制试验:分别用100μmol/L的Z-DEVD-FMK及Z-LEHD-FMK预处理细胞1 h再用2.0 mmol/L TCE染毒;EGb保护试验则以不同浓度（50、100、150 mg/L）的EGb预处理细胞2 h后再用2.0 mmol/L TCE进行染毒。分别观察下面各指标的变化:①MTT法检测细胞活力变化;②分光光度法检测caspase-3、caspase-8、caspase-9活力变化;③Annexin V-FITC/PI双染色后利用流式细胞仪检测细胞凋亡率变化。结果本研究发现:①细胞活力的变化:染毒时间为4 h时仅2.0 mmol/L TCE组细胞活力降低,染毒8 h时1.0 mmol/L TCE组细胞活力开始下降,和对照组相比,P<0.05,当染毒时间大于12 h,所有剂量组与对照组比较均有差异（P<0.05）,且随着染毒浓度的提高细胞活力呈剂量依赖性地降低。②caspase-3活性变化:染毒8 h时,1.0和2.0 mmol/L TCE组caspase-3活性较对照组明显增加（P<0.01）,染毒时间>12 h,各剂量组与对照组比较均有差异（P<0.01）;在12 h时各染毒组的caspase-3的酶活性达到峰值。③caspase-9及caspase-8活性变化:染毒8 h时,2.0 mmol/L TCE组caspase-9活性较对照组明显增加（P<0.01）,染毒时间超过12 h,各剂量组与对照组比较均有差异（P<0.01）;在12 h时各剂量组的caspase-9的酶活性均为最大值。而caspase-8酶活性在不同时间段各剂量组与对照组比较均无统计学意义（P>0.01）。④细胞凋亡率变化:不同剂量的TCE染毒12 h,随着剂量的增大,细胞凋亡率逐渐增加,呈明显剂量-效应关系。⑤caspase-3 inhibitor对观察指标影响:caspase-3 inhibitor预处理组caspase-3酶活性及细胞凋亡率较2.0 mmol/L TCE染毒组明显降低（P<0.01）,与空白对照组比较无统计学意义（P>0.01）;而caspase-9酶活性与2.0 mmol/L TCE染毒组比较无差异（P>0.01）,与对照组比较差异有显著性（P<0.01）。⑥caspase-9 inhibitor对观察指标的影响:caspase-9 inhibitor预处理组caspase-9、caspase-3酶活性及细胞凋亡率与2.0 mmol/L TCE染毒组比较有差异（P<0.01）,而与空白对照组比较无统计学意义（P>0.01）;⑦EGb的保护作用:50 mg/L EGb预处理后即可起到保护作用,其caspase-3、caspase-9酶活性及细胞凋亡率较2.0 mmol/L TCE染毒组明显降低（P<0.01）,当剂量为100 mg/L时,以上各指标与空白对照组比较无统计学意义（P>0.05）。结论研究结果提示在三氯乙烯诱导KC凋亡中,死亡受体途径可能不参与凋亡过程,而线粒体途径则扮演重要的角色,其主要依赖线粒体途径的caspase-9的活化来激活效应caspase-3进而介导凋亡,银杏叶提取物则可通过抑制caspase-9的活化来阻止细胞凋亡。本研究进一步探明了三氯乙烯的皮肤毒性机制,也为今后防治三氯乙烯职业损害,开发有效的皮肤防护用品提供了实验依据。

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