小鹅瘟病毒延边分离株VP3基因克隆及单管巢式PCR诊断方法的建立

论文摘要

小鹅瘟是由小鹅瘟病毒引起的主要侵害4-20日龄雏鹅和雏番鸭的一种急性或亚急性、高度接触性和败血性传染病,给养鹅业造成了严重危害。该病可从临床症状及流行病学特点作出初步诊断,但确诊需借助病原学检查、血清学方法和分子生物学技术。病原学检查和血清学方法均存在不够敏感、检测所需时间长等不足,不能满足临床快速诊断小鹅瘟的需要。而PCR技术具有敏感性高、特异性强等优点,能够较好满足临床快速准确诊断疾病的需要。本试验根据GenBank发表的小鹅瘟病毒B株全基因序列,针对VP3基因保守区,设计了一对扩增主要结构蛋白VP3基因的特异性引物,对小鹅瘟病毒延边分离株基因组DNA进行了PCR扩增,得到了与预期大小一致的VP3完整基因片段,将其回收纯化后与pGEM-T Easy载体连接;然后转化至大肠杆菌感受态细胞JM109中进行克隆,经酶切分析、PCR鉴定及序列分析,验证了所克隆的基因是小鹅瘟病毒VP3基因。同时,建立了小鹅瘟病毒单管巢式PCR诊断方法,扩增出了与预期片段大小相符的长度为406bp的基因片段。特异性试验表明,只有小鹅瘟病毒模板能扩增出特异性条带。敏感性试验表明,当病料中小鹅瘟病毒核酸含量为0.02175fg/μL时,仍可以检测到,出现清晰的特异性片段,比小鹅瘟病毒常规PCR诊断方法敏感性高100倍。应用小鹅瘟病毒单管巢式PCR诊断方法和小鹅瘟病毒常规PCR诊断方法分别对延边地区疑似小鹅瘟病死雏鹅80只进行了检测,有典型病理变化的20只病死雏鹅,阳性检出率均为100%（20/20）,无典型病理变化的60只病死雏鹅,小鹅瘟病毒单管巢式PCR诊断方法阳性检出率为93.3%（56/60）,而小鹅瘟病毒常规PCR诊断方法阳性检出率为80%（48/60）。由此可见,所建立的小鹅瘟病毒单管巢式PCR诊断方法较常规PCR诊断方法特异性和敏感性更强,可避免常规PCR诊断方法检测时造成的假阴性结果,为临床更快速准确诊断小鹅瘟提供一种有效的诊断手段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 小鹅瘟概述
• 2 小鹅瘟病毒生物学特性
• 3 小鹅瘟病毒基因组结构、编码蛋白及克隆与表达
• 3.1 基因组结构
• 3.2 基因组编码蛋白
• 4 小鹅瘟病毒与其他细小病毒关系
• 4.1 小鹅瘟病毒与番鸭细小病毒关系
• 4.2 小鹅瘟病毒与依赖病毒属成员关系
• 4.3 小鹅瘟病毒与红病毒属成员关系
• 5 小鹅瘟诊断方法研究进展
• 5.1 病原学检查
• 5.2 血清学诊断
• 5.3 分子生物学诊断
• 6 本研究的目的和意义
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 被检病料
• 1.2 对照病原体
• 1.3 菌种与质粒
• 1.4 酶类及主要试剂
• 1.5 试验用溶液及其配制
• 1.6 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 小鹅瘟病毒延边分离株VP3基因克隆
• 2.2 小鹅瘟病毒单管巢式PCR诊断方法建立
• 2.3 小鹅瘟病毒常规PCR诊断方法建立
• 结果
• 1 小鹅瘟病毒VP3基因克隆
• 1.1 VP3基因PCR扩增
• 1.2 目的基因克隆
• 1.3 重组质粒PCR鉴定
• 1.4 重组质粒单酶切鉴定
• 1.5 序列测定及分析
• 2 小鹅瘟病毒单管巢式PCR诊断方法建立
• 2.1 单管巢式PCR扩增
• 2.2 最佳退火温度
• 2.3 单管巢式PCR最佳反应程序
• 2.4 特异性试验
• 2.5 敏感性试验
• 2.6 应用性试验
• 3 小鹅瘟病毒常规PCR诊断方法建立
• 3.1 常规PCR扩增
• 3.2 最佳退火温度
• 3.3 常规PCR最佳反应程序
• 3.4 特异性试验
• 3.5 敏感性试验
• 3.6 应用性试验
• 3.7 几种诊断方法检测的比较
• 讨论
• 1 小鹅瘟病毒延边分离株VP3基因克隆与序列分析
• 2 小鹅瘟病毒单管巢式PCR诊断方法优越性
• 2.1 小鹅瘟病毒单管巢式PCR诊断方法中引物设计问题
• 2.2 小鹅瘟病毒单管巢式PCR诊断方法与病原学检查比较
• 2.3 小鹅瘟病毒单管巢式PCR诊断方法与现有PCR诊断方法比较
• 2.4 小鹅瘟病毒单管巢式PCR诊断方法与常规PCR诊断方法比较
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 附录（攻读学位期间发表论文目录）