与猪链球菌2型SntA蛋白互作的猪脑组织蛋白质的鉴定

论文摘要

猪链球菌（Streptocuccus suis）是当前严重危害养猪业的一种重要病原菌。根据荚膜多糖抗原成分的不同,将猪链球菌分为33个血清型,其中猪链球菌2型（S.suisserotype 2,SS2）是最常见和毒力最强的血清型之一,是一种重要的人兽共患病原菌,导致猪和人的脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎等病理变化,引起人的败血性休克。SS2进入宿主后,由定植部位进入血液循环,再突破血脑屏障进入中枢神经系统,引起脑膜炎。在这些感染过程中,细菌必然与宿主的多种细胞相互作用,发生损伤与抗损伤反应。SS2如何与宿主脑组织相互作用,是我们深入理解其突破血脑屏障并引起脑膜炎的分子机制中的一个重要方面。同样,研究SS2蛋白质与宿主肺组织的相互作用是解析肺炎发生机制的重要途径。SntA是SS2的一种外膜蛋白,含有明显的LPXTG膜锚定序列和RGD基序,推断为宿主整联蛋白的直接结合位点,可能在病原菌与宿主相互作用中起到重要作用。此外,SntA蛋白可能通过结合宿主体内血红素来获取螯合铁或者其他形式的铁,因此推断SntA可能是猪链球菌的一种毒力相关因子。本研究首先分别构建了猪脑组织和肺组织的酵母双杂交cDNA文库,然后运用酵母双杂交技术从猪脑组织cDNA文库中筛选到多个与SntA蛋白质相互作用的蛋白质,并进行了验证,主要研究成果如下:1.成功的分离、纯化了猪脑组织及肺组织的双链cDNA,构建了猪脑酵母双杂交cDNA文库及猪肺酵母双杂交cDNA文库,用于后续研究;2.运用酵母双杂交技术从猪脑组织cDNA文库中筛选到33个分别与SntA相互作用的阳性克隆。经PCR筛选、测序和结果分析,获得4个感兴趣的蛋白,分别为过氧化物酶（AOP2）、补体1q的A亚单位（C1qA）、泛素连接酶（Ubiquitin-conjugationenzyme）以及G蛋白（G protein）;3.为了降低假阳性发生率,经筛选后进行了回转实验验证,并选取AOP2和C1qA分别与SntA蛋白进行体外Pull-down验证,证明SntA分别与AOP2和C1qA相互作用。运用生物信息学,通过分析与预测,初步推断了SntA-AOP2和SntA-C1qA互作的原理及在SS2对宿主致病中所起到的作用。该结果为猪链球菌致病分子机制的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviation）
• 1 文献综述
• 1.1 猪链球菌的简介
• 1.1.1 猪链球菌的生物学特性
• 1.1.2 猪链球菌的流行病学
• 1.1.3 毒力因子
• 1.1.3.1 猪链球菌溶血素
• 1.1.3.2 荚膜多糖
• 1.1.3.3 溶菌酶释放蛋白和胞外蛋白因子
• 1.1.3.4 IgG结合蛋白
• 1.1.3.5 黏附
• 1.1.3.6 纤连蛋白结合蛋白
• 1.1.3.7 透明质酸裂解酶
• 1.1.3.8 Sortase
• 1.1.3.9 致病性基因-ORF2
• 1.1.3.10 38 KDa免疫保护性抗原
• 1.1.3.11 谷氨酸脱氢酶蛋白
• 1.1.3.12 血清透明因子
• 1.1.3.13 其它
• 1.1.4 致病机理
• 1.2 猪链球菌2型SntA蛋白的简介
• 1.3 猪链球菌2型与宿主间相互作用的意义及方式
• 1.3.1 中性粒细胞
• 1.3.2 巨噬细胞/单核细胞
• 1.3.3 上皮细胞
• 1.3.4 脉络丛上皮细胞
• 1.3.5 血管内皮细胞
• 1.3.6 其他
• 1.4 研究病原菌与宿主间蛋白相互作用的方法
• 1.4.1 噬菌体展示技术
• 1.4.2 等离子共振技术
• 1.4.3 荧光能量转移技术
• 1.4.4 抗体与蛋白质阵列技术
• 1.4.5 免疫共沉淀技术
• 1.4.6 Pull-down技术
• 1.4.7 酵母双杂交系统
• 1.4.7.1 酵母双杂交系统的作用原理
• 1.4.7.2 酵母双杂交系统的应用
• 1.4.7.3 酵母双杂交系统的优点
• 1.4.7.4 酵母双杂交系统中的常见问题
• 1.4.7.5 基于酵母双杂交系统的其它杂交系统
• 1.5 课题研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 动物品系
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 培养基、抗生素配制
• 2.1.4 主要试剂来源
• 2.1.5 使用溶液及储存液
• 2.1.5.1 琼脂糖凝胶电泳相关溶液
• 2.1.5.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）缓冲液
• 2.1.5.3 酵母转化相关溶液
• 2.1.5.4 酵母β-半乳糖苷酶检测法相关溶液
• 2.1.5.5 保菌用甘油
• 2.1.5.6 Westen-blot相关溶液
• 2.1.5.7 蛋白纯化与Pull-down相关试剂
• 2.1.6 寡核甘酸引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 酵母双杂交cDNA文库的构建
• 2.2.1.1 猪脑组织与肺组织RNA的提取
• 2.2.1.2 双链cDNA的合成
• 2.2.2 pGADT7-Rec质粒分别与猪脑双链cDNA及肺双链cDNA共转AH109感受态细胞
• 2.2.2.1 酵母菌株AH109营养表型的验证
• 2.2.2.2 酵母感受态细胞的小量制备
• 2.2.2.3 共转AH109感受态细胞
• 2.2.3 酵母文库的收集及分析
• 2.2.3.1 酵母文库的收集
• 2.2.3.2 酵母文库的鉴定
• 2.2.4 猪链球菌2型基因组的提取
• 2.2.5 sntA基因的克隆
• 2.2.6 酵母双杂交重组诱饵质粒的转化、自激活及毒性检测
• 2.2.6.1 酵母菌株Y187营养表型的验证
• 2.2.6.2 酵母菌株Y187感受态细胞的小量制备
• 2.2.6.3 诱饵质粒pGBKT7-sntA-N与pGBKT7-sntA-C分别转化Y187感受态细胞
• 2.2.6.4 pGBKT7-sntA-N与pGBKT7-sntA-C分别转化Y187后的自激活检测
• 2.2.6.5 转化的pGBKT7-sntA-N与pGBKT7-sntA-C对Y187毒性的检测
• 2.2.7 酵母双杂交文库的筛选
• 2.2.8 酵母双杂交阳性克隆子的鉴定
• 2.2.8.1 菌落PCR初步筛选
• 2.2.8.2 β-半乳糖苷酶检测lacZ报告基因的表达
• 2.2.8.3 酵母质粒的提取
• 2.2.8.4 阳性质粒测序,blast分析
• 2.2.9 阳性克隆子回转验证
• 2.2.10 体外蛋白质相互作用的Pull-down验证
• 2.2.10.1 pTYB12-AOP2与pTYB12-C1qA载体的构建
• 2.2.10.2 pTYB12-AOP2与pTYB12-C1qA靶蛋白诱导表达分析
• 2.2.10.3 pTYB12-AOP2与pTYB12-C1qA融合蛋白的纯化
• 2.2.10.4 pET28a-SntA-N蛋白的表达
• 2.2.10.5 pET28a-SntA-N蛋白的纯化
• 2.2.10.6 pTYB12-AOP2和pTYB12-C1qA融合蛋白分别与pET28a-SntA-N蛋白的Pull-down验证
• 2.2.11 Western-blotting检测
• 2.2.12 生物信息学分析方法
• 2.2.12.1 分析蛋白二级结构
• 2.2.12.2 预测作用位点
• 3.结果与分析
• 3.1 酵母菌株Y187及AH109营养表型的验证
• 3.2 猪脑组织酵母双杂交cDNA文库的制备
• 3.2.1 猪脑组织mRNA的提取
• 3.2.2 LD-PCR制备脑双链cDNA片段
• 3.2.3 猪脑组织酵母文库的收集及分析
• 3.2.4 猪脑组织酵母文库的进一步鉴定
• 3.3 猪肺组织酵母双杂交cDNA文库的制备
• 3.3.1 猪肺组织RNA的提取
• 3.3.2 LD-PCR制备肺双链cDNA片段
• 3.3.3 猪肺组织酵母文库的收集及分析
• 3.3.4 猪肺组织酵母文库的进一步鉴定
• 3.4 sntA基因的扩增与克隆
• 3.4.1 sntA基因的序列分析
• 3.4.2 sntA基因的克隆
• 3.4.3 重组诱饵质粒pGBKT7-sntA-N与pGBKT7-sntA-C的构建与鉴定
• 3.5 酵母双杂交重组诱饵质粒的酵母转化及相关检测
• 3.5.1 pGBKT7-sntA-N与pGBKT7-sntA-C分别转化Y187后的自激活检测
• 3.5.2 pGBKT7-sntA-N与pGBKT7-sntA-C分别对Y187毒性的检测
• 3.6 SntA-N与SntA-C蛋白分别与猪脑组织酵母文库互作蛋白的筛选与鉴定
• 3.6.1 阳性克隆的营养缺陷型筛选
• 3.6.2 β-半乳糖苷酶检测阳性克隆子
• 3.6.3 阳性克隆片段的测序与分析
• 3.7 阳性克隆子回转验证
• 3.8 体外蛋白质相互作用的Pull-down与Western-blotting验证
• 3.9 生物信息学预测SntA-N蛋白与AOP2及C1qA蛋白相互作用位点
• 4 讨论
• 4.1 酵母双杂交文库的构建
• 4.2 酵母双杂交技术筛选链球菌与宿主发生互作的蛋白
• 4.3 SntA蛋白与致病性的关系
• 4.4 酵母双杂交系统的假阳性
• 4.5 Pull-down体外验证实验
• 4.6 SntA与宿主免疫逃避的关系
• 4.7 SntA与细胞损伤的关系
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢