论文摘要
抗菌肽（Antimicrobial peptides）是由微生物、植物、无脊椎动物和各种脊椎动物的细胞和组织产生的一种有抗菌活性的多肽,也是生物体内先天免疫系统中的重要组成部分。因其具有独特的抗菌机理,抗菌肽有望替代抗生素成为新一代的抗微生物新药。但来源问题始终是抗菌肽研究和利用的瓶颈,为了解决抗菌肽的来源问题,依据牛源抗菌肽Indolicidin设计了抗菌肽LNK-16,并利用原核表达技术在大肠杆菌中成功地表达出了有抗菌活性的抗菌肽LNK-16。利用生物信息学的方法,在NCBI上找出抗菌活性高、抗菌谱广和分子量小的含有13个氨基酸残基并具有线性结构的牛抗菌肽Indolicidin,在其N端加入激肽释放酶的氨基酸识别位点（PFR）,形成新的多肽,命名为LNK-16。人工合成LNK-16,经抗菌活性检测其仍具有活性,为串联表达产物的蛋白酶切打下基础。把三个LNK-16进行串联,根据串联的氨基酸残基和大肠杆菌的偏爱密码子,反向翻译出它的基因片段。在片段两端加入EcoR I和Xho I两个限制性酶切位点和它们的保护碱基,形成总片段为178 bp的目的基因。利用SOEing-PCR设计引物的方法把目的基因片段设计成四段互补的重叠核苷酸序列,人工合成这四段序列,用TD-PCR方法扩增出目的基因,把目的基因和质粒载体pET-30a（+）进行双酶切,用T4 DNA连接酶构建出质粒载体pET-30a（+）-LNK-16,经过双酶切、PCR和核苷酸序列测定,结果表明载体构建成功。经优化实验,确定最佳诱导表达条件为终浓度500μmol/L的IPTG在37℃、pH7.2条件下诱导表达10 h。用SDS-PAGE对表达的蛋白进行检测,其表达量约占菌体总蛋白的32.6%,并且以包涵体的形式存在。用TrionX-100溶液清洗包涵体最后溶解在8mol/L的尿素中通过透析复性,然后在三乙醇胺缓冲液中用激肽释放酶酶切,酶解液总蛋白含量为0.307 mg/mL,其中LNK-16的理论含量约为1/2左右,用双层琼脂扩散法检测其抗菌活性,对大肠杆菌酶切1 h产物的抗菌活性最高,抑菌圈为1.06 cm,说明表达产物具有抗菌活性,从而为解决抗菌肽的来源问题提供了新的方法。