构建辣椒T-DNA插入突变库的转化影响因子

论文摘要

T-DNA标签法转化植物建立突变体库是植物功能基因组研究的重要而有效的方法。为了开展我省重要蔬菜作物——辣椒的功能基因组研究,我们开展了以辣椒自交品系H8214为材料的T-DNA标签转化。以pUC18及pWM101为出发质粒,构建能够用于质粒拯救的T-DNA标签质粒pWM101+Ampr同时选取通用的激活表达标签质粒pSKI015及两种农杆菌菌系LBA4404、GV3101,形成四种工程农杆菌:LBA4404（pWM101+Ampr）、GV3101（pWM101+Ampr）、LBA4404（pSKI015）及GV3101（pSKI015）。分别转化辣椒的不同外植体,以探索适合H8124 T-DNA遗传转化及突变库构建的转化条件。采用MS基本培养基,诱导辣椒芽分化。研究外植体类型,6-BA/NAA配比和DJ,AgNO3、苗龄、暗处理、培养基pH、蔗糖浓度、外植体接种密度等因素对芽分化的影响。结果表明,使用子叶为外植体再生效果比下胚轴好。培养基添加NAA不利于H8124芽的分化,且容易生根。在MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0mg/L的培养基上,辣椒子叶芽分化率最高达52%,加入DJ、硝酸银分化率可提高到62%6-BA 3.0mg/L时芽生长较旺盛,添加GA3浓度为4 mg/L时芽伸长效果较好,确定6-BA 3.0mg/L+GA3 4 mg/L为芽伸长的最适激素组合。添加4mg/L DJ和10 mg/L AgNO3能提高芽的伸长率。琼脂用量为4.5 g/L,采用半透性塑料薄膜封口,可基本达到芽较好伸长所需的外界环境条件。使用0.5 mg/LNAA生根效果较好。通过研究影响辣椒转化再生的因素,结果表明:400 mg/L的头孢霉素可有效抑制农杆菌的生长,同时对子叶的分化影响不大。PPT浓度为0.5 mg/L,潮霉素为50 mg/L辣椒芽的分化被完全抑制,此浓度可作为辣椒遗传转化的选择压。将外植体预培养2d,将处于对数生长期的农杆菌稀稀释到原浓度的1/2,侵染子叶5min,共培养1d,延迟选择4d,可获得20%左右的抗性芽。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 植物功能基因研究进展
• 1.1 功能基因组学
• 1.2 T-DNA作为标签所具有的特点及标签的设计原则
• 1.3 获得T-DNA标签标记的植物群体
• 1.4 被标记基因的获得与功能分析
• 2 辣椒再生体系建立的研究进展
• 3 辣椒转基因技术研究
• 4 本论文的研究意义
• 第二章 T-DNA标签质粒构建及转化农杆菌
• 1 材料与试剂
• 1.1 菌株
• 1.2 质粒
• 1.3 工具酶及试剂
• 1.4 溶液和培养基
• 1.5 试剂盒
• 2 实验方法
• 2.1 T-DNA标签质粒pWMl01-Ampr的构建及转化农杆菌
• 2.2 重组质粒pWMl01-Amprr转化根癌农杆菌
• 2.3 T-DNA标签质粒pSKI015提取及转化农杆菌LBA4404
• 3 结果与分析
• r的流程图'>3.1 构建重组质粒pWM101-Amp^r的流程图
• 3.2 提取质粒pUC18及pWM101的电泳检测结果
• 3.3 双酶切处理pWM101和pUC18,大片段回收电泳检测结果
• r的酶切电泳检测结果'>3.4 重组质粒pWM101-Amp^r的酶切电泳检测结果
• r转入LBA4404和GV3101的结果'>3.5 菌落PCR检测pWM101-Amp^r转入LBA4404和GV3101的结果
• 3.6 菌落PCR检测质粒pSK1015转入LBA4404的结果
• 4.讨论
• 第三章 辣椒H8124高效再生体系的建立
• 1 材料与试剂
• 1.1 辣椒材料
• 1.2 培养基及激素
• 2 实验方法
• 2.1 辣椒H8124无菌苗的培养
• 2.2 辣椒H8124外植体不定芽诱导和分化条件摸索
• 2.3 影响不定芽伸长因素的研究
• 2.4 再生芽的生根及移栽
• 3 结果与分析
• 3.1 不定芽的诱导分化
• 3.2 不定芽的伸长
• 3.3 生根培养基的确定
• 4 讨论
• 第四章 影响农杆菌介导的T-DNA标签质粒转化辣椒H8124因素的研究
• 1 材料和试剂
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 植物材料及培养基
• 1.3 试剂
• 2 实验方法
• 2.1 农杆菌的活化与制备
• 2.2 供转化的外植体获得
• 2.3 选择培养压力的确定
• 2.4 头孢霉素使用浓度的确定
• 2.5 转化方法
• 2.6 不同因素对转化的影响研究
• 3 结果与分析
• 3.1 选择压力的确定
• 3.2 头孢霉素对不定芽分化的影响
• 3.3 辣椒抗性植株的再生及不同转化条件对辣椒转化再生的影响
• 4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录A 主要试剂配置
• 附录B 缩略词表
• 致谢
• 作者简历