论文摘要
目的:探讨HYZ在体外对食管癌Eca-109细胞生长、增殖及周期的影响及其作用机制。方法:1.体外培养食管癌细胞株Eca-109,倒置显微镜观察细胞形态的变化,并计算倍增时间;2.采用MTT法测定HYZ对Eca-109细胞增殖的影响;3.Hoechst 33342/PI双荧光染色检测HYZ作用前后细胞凋亡情况;4.DNA Ladder技术检测HYZ作用前后细胞凋亡情况;5.流式细胞仪检测HYZ作用前后的凋亡率和周期阻滞。结果:1.Eca-109细胞经过3天的培养、记数,计算出其倍增时间为14.69h;倒置显微镜观察对照组Eca-109细胞为贴壁生长,细胞生长速度快,形态不规则,呈三角形、梭形和多边形,核居中、大而圆,药物组细胞数量较对照减少,随HYZ作用时间的延长,越来越多的细胞由多边形变成圆形,胞质内出现空泡,体积变小,折光度下降,部分细胞脱壁呈半悬浮状态,随后细胞皱缩,裂解似爆开的“菜花”状,在10ug/ml浓度作用48h后变化最为明显。2. MTT比色实验结果显示,HYZ处理Eca-109细胞1～4d后,OD570（A值）值分别比未经处理的Eca-109细胞显著下降（P<0.01）,细胞存活率随着剂量的的增大显著下降,并且随着药物的作用时间的增长而明显下降,并呈时效和量效关系;半数抑制浓度（IC50）为2.5μg/ml; 10μg/mlHYZ作用Eca-109细胞48h,可明显抑制细胞生长;3.Hoechst33342/PI的结果,在荧光显微镜下观察发现,对照组活细胞大小一致,被透过活细胞膜的Hoechst33342染成蓝色,荧光均匀,少见细胞膜破裂从而被PI染成橘红色的坏死细胞。实验组细胞Hoechst33342/PI染色也呈蓝色,细胞体积缩小,胞质浓缩,胞核固缩,染色质凝集,边缘化,核碎裂,染色质分割成块,细胞呈亮珠状蓝色荧光和形成凋亡小体等典型的凋亡细胞形态改变,晚期凋亡细胞染色呈橘红色,但仍可见典型细胞核染色质凝集改变。4.琼脂糖凝胶电泳显示,Eca-109细胞其DNA在凝胶上电泳痕迹为一条距加样孔很近的大分子条带,正常分子质量100kb以上;浓度为10μg/ml的HYZ,HYZ处理后第48h提取的DNA电泳出现明显的梯状带（DNA Ladder）; 5.流式细胞仪凋亡率的检测, Eca-109细胞加入10μg/ml浓度HYZ,分别作用于24、48和72h,通过亚G1峰检测其凋亡率分别为（6.41±0.09）%、（18.38±0.11）%、（27.35±0.27）%、（17.73±1.22）%、（32.55±2.73）%,其中Eca-109细胞加入10μg/ml浓度HYZ分别作用24、48和72h与对照组相比,细胞凋亡率差异有统计学意义,t值分别为32.80、31.46、29.73和25.99,P值均为0.000。流式细胞仪检测HYZ作用后的肿瘤细胞出现亚二倍体凋亡小峰,G0/G1期细胞百分率明显升高,由对照组的（56.57±1.67）%增加到（82.24±1.38）%,F=139.431,P=0.000;同时处于S期的细胞数减少,由对照组的（23.43±8.55）%减少到（12.35±2.11）%,F=141.239,P=0.000。细胞出现G0/G1期阻滞。结论:随着HYZ浓度和作用时间的增加对Eca-109细胞的体外抑制效应增加,HYZ通过引起Eca-109细胞G0/ G1周期阻滞而发生凋亡,起到杀伤肿瘤的作用。