北极海域微型浮游真核生物的多样性、生态分布及微微型青绿藻（picoprasinophytes）的生态地位

论文摘要

微型/微微型浮游真核生物普遍存在于高纬度海域的真光层中,具有异常丰富的多样性,是微型食物链的基础,在海洋生态系统中占有十分重要的地位。在受全球变化影响明显的北极近岸海域,该类群对生态系统产生着重要影响。本研究以高纬度近岸海域微型浮游真核生物（≤50μm）为研究对象,利用梯度变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（DGGE）技术分析该类群的物种组成和时空分布差异,同时设计特异性分子探针,综合评估微微型浮游真核生物（≤5μm）中优势种群丰度和生物量组成。另外,利用我国第三次北冰洋考察获得的北冰洋中心海域样品,构建SSU rRNA基因文库,研究北冰洋中心海域的微型真核生物多样性。并利用荧光原位杂交法（FISH）（≤5μm）和流式细胞术计数（FCM）（≤3μm）综合评估微微型浮游真核生物,尤其是微微型青绿藻在北冰洋中心海域的生态学地位。主要研究结果如下：1.运用DGGE技术,分析了2008和2009年夏季王湾（N78°59.29’,E 11°39.60’）微型浮游真核生物群落结构的空间分布特征。DGGE图谱显示,王湾具有丰富的微型浮游真核生物多样性和显著的空间差异,外湾和内湾群落结构差异明显,不同站位具有不同的微型真核生物多样性。典型对应分析（CCA分析）显示,温度和盐度是影响王湾微型真核生物群落结构的主要环境因子。DGGE测序结果显示,2009年K3站位的主要真核类群有Syndiniales、Chamaeleomyces granulomatis、Calanus sinicus和Chrysophyceae sp.。造成湾内外群落多样性差异显著的可能原因有：大西洋暖流为该地区的沿岸带来的高温高盐海水、夏季冰川融水注入湾内产生的温度和盐度梯度变化以及冬季海冰覆盖等。这导致了湾内水体温度、盐度、浑浊度改变迅速,生态环境复杂多变,造成生物多样性各异。2.对北冰洋中心海域B80-20 m和B85-0 m的海水样品分别进行了SSU rRNA克隆建库。获得了CNCⅢ05和CNCⅢ51两个SSU rRNA基因文库。分析表明,CNCⅢ05具有丰富的生物多样性,共包含有5个生物类群：alveolates、stramenopiles、metazoans、chlorophytes和telonema。CNCⅢ51文库除了上述五种之外,还有picobiliphytes和Choanoflagellida。在两个基因库中,与Micromonas pusilla相关的物种是最常被检测到的克隆子之一。而通过克隆文库估算曲线分析物种相对丰富度发现,本研究中通过基因文库显示的物种丰富度可能被低估。相关海域环境样品的宏基因组文库构建及焦磷酸测序技术的应用可帮助我们更深入了解该海域的多样性信息。3.用实验室纯培养的两株极地藻种（Chlorella vulgaris, Micromonas sp.）,设置不同的杂交条件,包括酶处理、变性剂甲酰胺浓度、杂交温度和时间、探针浓度等,对荧光原位杂交技术进行了优化。优化后的杂交条件为：1)10mg mL-’的溶菌酶37℃预处理30 min；2)杂交液甲酰胺浓度为40%；3)20μ1杂交液中探针浓度为2μM；4)杂交条件为47℃杂交6 h。并且,通过FISH、FCM和DAPI计数比较显示,杂交前后细胞数量无显著差异,表明优化后的杂交体系具有很高的杂交效率,可以应用于北极海域环境样品的定量分析。4.第三次科学考察北冰洋中心海域样品的FISH结果显示,微微型浮游真核生物的丰度较高,达到1.94 X 103-2.37X 104cells mL1（平均丰度为7.13 X 103 cells mL-1）。其中,微微型青绿藻（picoprasinophytes）占25.45%-86.89%（平均比例为44.37%）,为主要优势类群之一。FCM结果显示,微微型真核生物的丰度为0.955×103-1.073X104cells mL-1。FISH计数（≤5μm）和FCM计数（<3μm）结果显示从所有站位样品获得的微微型真核生物的丰度变动趋势基本相似,但FISH计数显示的丰度稍高。FISH调查结果证明,以Micromonas为主的微微型青绿藻在北冰洋中心海域厚重冰盖下发挥着“隐蔽且异常重要”的生态作用。5.应用荧光原位杂交技术对2008年北极王湾50m以上水层微微型浮游真核生物进行监测。结果显示,微微型真核生物的丰度为0.821 X 103-23.38 X 103cells mL-1,微微型青绿藻丰度为0.25 X 103-6.64 X 103cells mL-1占微微型真核生物的11.63%-54.64%,平均为29.11%。尽管夏季北极王湾海域受各种水团以及周边快速变动环境因子的影响,微微型青绿藻依然是该沿岸生态系统中非常重要的角色。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 绪论
• 1 前言
• 2 分子生物学技术在微型和微微型浮游真核生物研究中的应用
• 3 国内外研究现状及进展
• 3.1 微型与微微型真核生物多样性
• 3.2 微微型浮游真核生物在北冰洋的生态地位
• 3.3 微微型青绿藻的生态学地位
• 4 本研究的方案、目标及意义
• 第二章 材料与方法
• 1 采样地点概况及样品采集
• 1.1 北极王湾
• 1.2 北冰洋中心区域
• 1.3 样品采集
• 2 遗传多样性分析方法
• 2.1 DNA抽提及PCR扩增
• 2.2 琼脂糖凝胶电泳
• 2.3 SSU rRNA克隆文库构建
• 2.4 变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析
• 3 荧光原位杂交定量分析方法
• 3.1 藻种的选取与培养
• 3.2 细胞收集与固定
• 3.3 探针的设计
• 3.4 细胞膜通透性优化
• 3.5 杂交过程及杂交条件的优化
• 3.6 荧光显微镜观察和数据分析
• 4 流式细胞仪计数
• 第三章 北极王湾海域微型真核生物生态学分布
• 1 北极王湾水文条件
• 1.1 2008年北极王湾温度、盐度及叶绿素分布
• 1.2 2008年北极王湾营养盐分布
• 2 北极黄河站地区王湾微型真核生物多样性时空分布特征
• 2.1 基于DGGE图谱的王湾微型浮游真核生物多样性分析
• 2.2 DGGE分析2009年王湾K3站位微型浮游真核生物垂直分布特征
• 3 讨论
• 第四章 北冰洋中心海域微型浮游真核生物多样性
• 1 北冰洋中心海域水文状况
• 1.1 温度、盐度、叶绿素及营养盐分布
• 2 微型真核生物多样性
• 3 讨论
• 第五章 picoprasinophytes在北极高纬海域的生态学地位
• 1 FISH条件优化
• 2 2008年夏季北冰洋中心海域微微型真核生物及微微型青绿藻的丰度
• 2.1 FISH优化条件应用于北冰洋中心海域环境样品
• 2.2 微微型真核生物及微微型青绿藻丰度
• 2.3 FISH计数（≤5μm）与FCM计数（≤3μm）的比较
• 3 2008年夏季王湾微微型真核生物（≤5μm）及微微型青绿藻的丰度
• 3.1 微微型真核生物及微微型青绿藻垂直分布
• 3.2 不同站位和深度的微微型真核生物及微微型青绿藻比较
• 3.3 不同站位的微微型真核生物及青绿藻比较
• 3.4 微微型青绿藻在微微型真核生物中所占份额
• 4 讨论
• 4.1 微微型青绿藻在北冰洋中心海域的重要生态地位
• 4.2 微微型青绿藻在北极沿岸的王湾的生态作用
• 第六章 总结与展望
• 1 创新点
• 2 不足与展望
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间参与的课题和论文发表情况
• 1 参加的科研项目
• 2 已发表或投稿论文