棉花遗传多样性研究及抗黄萎病相关基因的克隆与分析

论文题目: 棉花遗传多样性研究及抗黄萎病相关基因的克隆与分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物遗传育种

作者: 朱龙付

导师: 张献龙

关键词: 陆地棉,遗传多样性,海岛棉,黄萎病,抑制差减文库,抗病相关基因,病程相关蛋白

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 遗传多样性的量化与分类是收集和利用种质资源的重要前提。利用简单重复序列(SSRs)和随机扩增多态性DNAs(RAPDs)两种分子标记对来自我国各个棉区的30份陆地棉转基因种质材料进行了遗传多样性分析,材料包含有我国的现有的三种转基因类型。利用NTSYS-pc 2.10统计分析软件,采用Jaccard’s相似系数UPGMA法进行聚类。结果表明三类转基因材料大致分为不同的两类,而且不同棉区的转基因材料交叉分布。相似系数分析表明,我国转基因材料的遗传多样性相对较为丰富。 同时利用这两种分子标记对31份陆地棉种质资源进行了遗传多样性分析,其中14份材料是最近从美国和伊朗引进。从有多态性的21个RAPD引物和18对SSR引物中共获得117个多态性位点。利用NTSYS-pc 2.10统计分析软件,采用Jaccard’s相似系数UPGMA法进行聚类。结果表明从国内来的17份材料部分聚为一类,从国外来的14份材料大部分聚为另一类,其他材料相间排列;分别对31份材料的相似系数和来自中国的17份材料的相似系数进行了比较分析,国内材料相对于新引进的国外材料的遗传多样性水平稍高,国内和国外材料之间的遗传差异较大。这说明扩大不同地区间种质资源的交流和引进种质资源可以丰富本地材料的遗传多样性。现阶段积极引进、正确评价和有效利用种质资源仍具有重要意义。 黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae kleb.)引起的土传性真菌维管束病害,近年来在世界上对棉花和许多作物造成严重的产量和品质损失。本研究以对黄萎病有抗性的海岛棉Pima 90为材料,利用改良的异硫氰酸胍法抽提棉花根组织材料的总RNA。在幼苗接种黄萎病病原菌后2、4、8、12、24、48、72和96 h分别取幼根以抽提棉花总RNA。以未接种病原的棉花cDNA为驱动方,以接种病原的棉花cDNA为试验方,利用SSH法对接种病原后的棉花cDNA进行差减杂交以分离对抗病反应的基因。SSH文库包含534个克隆,以M13引物对扩增插入片段进行PCR扩增,电泳结果显示插入片段大小从0.2至1.2 kb不等,平均大小为0.5 kb。将克隆中的插入片段点种于尼龙膜上,分别以病原诱导前后的总cDNA为探针进行反向Northern杂交。对88个在海岛棉的抗病反应中表达有差异的克隆进行了测序并对测序结果在NCBI上利用Blastn和Blastx进行序列相似性分析。结果表明大部分阳性克隆与拟南芥、棉花等多个物种不同逆境条件下诱导的相关基因或表达序列相同或同源。鉴定到一些与抗病反应相关的基因如棉花病程蛋白家族10、拟南芥抗病反应蛋白家族、谷胱甘肽S转移酶等。同时分离到一些参与转录和信号转导的因子如MYB转录因子家族、转导蛋白家族WD-40 repeat和Cys2/His2类的锌指蛋白等。两个与植物激素调节相关基因同源的EST可能在棉花抗病反应中起作用。SSH文库的构建和分析将有助于了解棉花抗黄萎病反应的分子机制。 从SSH文库中分离到两个海岛棉受黄萎病诱导表达的基因GbPR 1和GbPR 2。GbPR 1转录本长为701碱基,包含一个528碱基的完整开放阅读框。它编码一个

论文目录:

摘要

ABSTRACT

第一部分 棉花种质资源遗传多样性分析

1 前言

1.1 课题的提出

1.2 前人的研究工作

1.2.1 形态学水平

1.2.2 同工酶水平

1.2.3 系谱水平

1.2.4 DNA水平

1.2.4.1 RFLP

1.2.4.2 RAPD标记

1.2.4.3 AFLP标记

1.2.4.4 SSR标记

1.2.4.5 棉花rDNA间隔序列长度的多样性研究

1.3 本研究的目的与内容

2 转Bt基因抗虫棉品种(系)的遗传多样性分析

2.1 材料与方法

2.1.1 植物材料

2.1.2 引物

2.1.3 棉花总DNA的抽提

2.1.4 RAPD分析

2.1.5 SSR分析

2.1.6 谱带的记录及数据分析

2.2 结果与分析

2.2.1 转基因抗虫棉材料聚类结果分析

2.2.2 转基因抗虫棉材料的相似系数分析

2.2.3 转基因材料的分子指纹图谱

2.3 小结

3 国内外陆地棉种质资源的遗传多样性分析

3.1 材料与方法

3.1.1 植物材料

3.1.2 引物

3.1.3 棉花总DNA的抽提

3.1.4 RAPD分析

3.1.5 SSR分析

3.1.6 谱带的记录及数据分析

3.2 结果与分析

3.2.1 31份陆地棉材料的遗传多样性分析

3.2.2 中国国内品种的遗传多样性分析

3.2.3 国内材料的系谱分析

3.2.4 中国与国外陆地棉品种的遗传多样性比较分析

3.3 小结

4 讨论

第二部分 棉花抗黄萎病相关基因的克隆与分析

第一章 前言

1.1 课题的提出

1.2 前人的研究工作

1.2.1 黄萎病病原菌及其致病机理

1.2.1.1 黄萎病病原菌

1.2.1.2 发病条件

1.2.1.3 黄萎病的致病机理

1.2.1.4 黄萎病对棉花内源激素的影响

1.2.1.5 黄萎病的防治

1.2.2 棉花黄萎病的抗病遗传学研究

1.2.3 棉花与黄萎病菌互作的组织化学与生理生化反应研究

1.2.4 棉花与黄萎病互作的分子生物学研究

1.3 棉花RNA的抽提

1.4 基因差异表达的研究方法

1.4.1 基于cDNA的PCR扩增方法

1.4.2 减法杂交

1.4.3 cDNA代表性差异分析

1.4.4 抑制差减杂交

1.4.5 基因芯片技术

1.4.6 基因表达系列分析法

1.4.7 基于蛋白水平的差异基因的分离

1.4 本研究的目的与内容

第二章 黄萎病菌诱导的棉花抑制差减文库的构建及分析

2.1 植物材料与病原菌

2.2 实验方法

2.2.1 植物材料的处理方法

2.2.1.1 病原菌接种方法

2.2.1.2 棉花根部总RNA的抽提及mRNA的分离

2.2.1.3 cDNA的合成和cDNA抑制差减杂交

2.2.1.4 抑制差减文库的构建及克隆的插入片段的检测

2.2.1.5 反向Northern杂交

2.2.1.6 测序及序列相似性搜索

2.3 结果与分析

2.3.1 海岛棉的抗病性接种鉴定

2.3.2 RNA质量检测及mRNA的分离

2.3.3 双链cDNA的合成及酶切

2.3.4 差减文库的滴度与文库中克隆插入片段的大小

2.3.5 反向Northern杂交筛选差异表达克隆

2.3.6 测序与同源检索结果

2.3.7 基因功能的相关分析

2.4 讨论

2.4.1 棉花RNA的抽提

2.4.2 棉花抗病反应中基因的表达

2.4.3 本实验中存在的问题及SSH文库构建和分析

第三章 部分棉花抗病反应相关基因的克隆与分析

3.1 材料与方法

3.1.1 植物材料与处理

3.1.2 RT-PCR

3.1.3 Northern杂交

3.1.4 Southern杂交

3.2 结果与分析

3.2.1 棉花抗病反应相关基因GbPR1和GbPR2的分析

3.2.1.1 GbPR1的序列分析

3.2.1.2 GbPR1的生物信息学分析

3.2.1.3 GbPR1和拟南芥抗病反应相关蛋白的生物信息学比较分析

3.2.1.4 GbPR2的序列分析

3.2.1.5 GbPR1和GbPR2的比较分析

3.2.1.6 GbPR1的表达分析

3.2.1.7 GbPR1的基因组分析

3.2.2 MIC-3参与了棉花抗黄萎病反应

3.3 讨论

3.3.1 木质素合成相关基因与植物抗病

3.3.2 生物信息学在植物基因研究中的作用

3.3.3 MIC-3的功能

第四章 病程相关蛋白-10在棉花抗病反应中的鉴定及其在植物中的进化分析

4.1 材料与方法

4.1.1 植物材料

4.1.2 DNA抽提、PCR扩增、Northern杂交和Southern杂交

4.1.3 PCR产物的克隆、测序和基因系统进化分析

4.2 结果与分析

4.2.1 PR-10基因在棉花中的表达模式

4.2.2 棉属中PR-10基因的遗传多样性

4.2.3 PR-10基因家族在棉属中的系统进化分析

4.2.4 植物PR-10的蛋白序列特征及其系统进化

4.3 讨论

4.3.1 棉花PR-10基因在棉花抗病反应中的作用

4.3.2 棉属PR-10蛋白的系统进化与其功能

4.3.3 PR-10蛋白在植物中功能的多样性及其进化

参考文献

致谢

附录Ⅰ Protocol and method

附录Ⅱ 转基因棉花材料的遗传相似系数

附录Ⅲ 植物PR-10蛋白之间的遗传距离

附录Ⅳ 棉属各种间PR-10家族的基因组序列的部分序列对比

附录Ⅴ 植物PR-10蛋白的多序列对比

附录Ⅵ 攻读博士学位期间发表论文情况

发布时间: 2005-12-05

参考文献

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• [4].白菜型油菜的遗传多样性及特殊种质资源的研究[D]. 何余堂.华中农业大学2004
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