生物转化β-氨基丙腈生产β-氨基丙酸的菌株鉴定及其在生物反应器中的转化研究

论文摘要

β-氨基丙酸作为一种多用途有机原料,是制备肌肽、泛酸（维生素B5）等产品的重要中间体,广泛应用于化工和制药行业。本研究筛选得到一株能转化β-氨基丙腈生产β-氨基丙酸的菌株G20,并对菌株进行鉴定;以静息细胞为催化剂,设计鼓泡式反应器,对转化条件进行研究;将静息细胞固定化,对制备工艺、固定化细胞特性进行研究;以固定化细胞为催化剂,设计密集多相流反应器和填充床反应器,对转化过程进行研究。通过形态特征观察、生理生化测定、Biolog GP2鉴定以及16S rDNA序列相似性和系统发育分析,对筛选得到的菌株G20进行鉴定,确定为红串红球菌（Rhodococcus erythropolis）。对其转化能力进行初步研究,发现该菌可能存在腈水合酶、酰胺酶双酶体系,也可能存在腈水解酶、腈水合酶、酰胺酶三酶体系。设计工作容积为200mL的鼓泡式反应器,采用静息细胞进行批式转化。利用响应面法对转化条件进行优化,当菌体量16.50gww/200mL,底物浓度1.29%（v/v）,通气量86.56L/h时,β-氨基丙酸的产率达到6.45g/（Lh）。对转化温度和缓冲液初始pH进行研究,较优值分别为30℃和7.5。研究了温度对扩散的影响,得到扩散活化能Ea=22199 J/mol,表明存在扩散阻力。对转化体系的稳定性进行研究,得到半衰期t1/2约为46.83h,相当于11个批次。采用海藻酸盐包埋法,对静息细胞进行固定化。较优固定化条件:菌体浓度5%,海藻酸钠浓度3%,CaCl2浓度3%,颗粒直径2mm。采用响应面法,进一步研究PEI浓度,pH,Ca2+浓度对固定化颗粒转化能力和机械强度的影响,结果表明:当PEI浓度为0.34%,pH为8.0,Ca（2+）浓度为41.75mmol/L时,转化效果最好,当PEI浓度为0.48%,pH为7.6,Ca2+浓度为52.15mmol/L时,机械强度最佳。对固定化细胞的特性进行研究。发现最适转化体系为生理盐水,最适转化温度35℃,最适底物浓度1.2%,经强化处理的固定化细胞半衰期为12批。对密集多相流反应器进行研究,发现固定化细胞使用3批后,活力明显下降,通气产生的剪切力会对固定化颗粒造成影响。对填充床反应器进行研究,最佳温育反应温度40℃,温育时间15h,流加温度35℃,流加速度0.2mL/min,连续操作下,半衰期约3天。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 腈类化合物及腈转化酶的概述
• 1.1.1 腈水解酶
• 1.1.2 腈水合酶
• 1.1.3 酰胺酶
• 1.2 β-氨基丙酸
• 1.2.1 β-氨基丙酸的生产方法
• 1.2.2 β-氨基丙酸的应用
• 1.3 生物转化过程中的生物反应器
• 1.3.1 填充床反应器
• 1.3.2 密集多相流反应器
• 1.3.3 双水相反应体系
• 1.3.4 膜生物反应器
• 1.3.5 微生物转化过程中反应器的研究趋势
• 1.4 本课题的研究背景、意义及主要内容
• 1.4.1 研究背景和意义
• 1.4.2 主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 转化β-氨基丙腈生产β-氨基丙酸的微生物菌种筛选与鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 菌株的分离和筛选
• 2.3.2 菌落及菌体形态特征
• 2.3.3 生理生化特征
• 2.3.4 Biolog GP2分析
• 2.3.5 16S rDNA序列测定及系统发育分析
• 2.3.6 转化能力的初步研究
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第三章 Rhodococcus erythropolis G20静息细胞在鼓泡式反应器中转化β-氨基丙腈生产β-氨基丙酸的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种及培养基
• 3.2.2 细胞培养
• 3.2.3 色谱条件
• 3.2.4 反应器设计
• 3.2.5 菌体量对转化的影响
• 3.2.6 底物浓度对转化的影响
• 3.2.7 通气量对转化的影响
• 3.2.8 响应面法设计实验方案
• 3.2.9 温度及缓冲液初始pH对转化过程的影响
• 3.2.10 转化进程的研究
• 3.2.11 批次实验
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 单因素实验
• 3.3.2 响应面优化实验
• 3.3.2.1 回归模型的建立与检验
• 3.3.2.2 响应面与等高线图
• 3.3.2.3 最佳组合的求解及验证
• 3.3.3 温度与缓冲液初始pH对转化的影响
• 3.3.4 最佳条件下的时间进程曲线
• 3.3.5 转化体系的稳定性研究
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第四章 Rhodococcus erythropolis G20固定化细胞的制备及其在反应器中的转化条件研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 固定化材料
• 4.2.2 静息细胞的制备
• 4.2.3 固定化细胞的制作
• 4.2.4 固定化细胞的强化
• 4.2.5 最佳固定条件的确定
• 4.2.6 最佳强化条件的确定
• 4.2.6.1 聚乙烯亚胺浓度及强化时间对固定化颗粒影响
• 4.2.6.2 聚乙烯亚胺的pH值对强化作用的影响
• 4.2.6.3 戊二醛浓度及交联时间对转化率的影响
• 2+对强化作用的复合影响'>4.2.6.4 聚乙烯亚胺、pH、Ca²⁺对强化作用的复合影响
• 4.2.7 固定化细胞特性研究
• 4.2.7.1 固定化细胞的形态观察
• 4.2.7.2 转化体系的研究
• 4.2.7.3 最适温度及热稳定性研究
• 4.2.7.4 最佳底物浓度的确定
• 4.2.7.5 批次实验
• 4.2.8 固定化细胞在反应器中转化的初步研究
• 4.2.8.1 密集多相流反应器的初步研究
• 4.2.8.2 填充床反应器的初步研究
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 正交设计法优化固定化条件
• 4.3.2 最佳强化条件的研究
• 4.3.2.1 聚乙烯亚胺浓度及强化时间对固定化颗粒的影响
• 4.3.2.2 聚乙烯亚胺的pH值对强化作用的影响
• 4.3.2.3 戊二醛浓度及交联时间对转化率的影响
• 2+对强化作用的复合影响'>4.3.2.4 聚乙烯亚胺、pH、Ca²⁺对强化作用的复合影响
• 4.3.3 固定化细胞特性研究
• 4.3.3.1 固定化细胞的形态观察
• 4.3.3.2 最佳转化体系的研究
• 4.3.3.3 最适温度及热稳定性研究
• 4.3.3.4 最佳底物浓度的研究
• 4.3.3.5 批次实验
• 4.3.4 固定化细胞在反应器中转化的初步研究
• 4.3.4.1 密集多相流反应器中转化进程的初步研究
• 4.3.4.2 填充床反应器的初步研究
• 4.3.4.2.1 最佳温育时间及温度的确定
• 4.3.4.2.2 最佳流速的确定
• 4.3.4.2.3 转化体系稳定性检测
• 4.4 小结
• 参考文献
• 第五章 总结与建议
• 5.1 总结
• 5.2 建议
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文