论文摘要
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是老年人群中常见的神经退行性疾病之一,随着社会人口老龄化其发病率逐年升高。神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）是AD患者脑中典型的病理学特征之一,NFTs的主要成分是异常过度磷酸化的微管相关蛋白tau聚集形成的双螺旋细丝（paire helical filaments, PHFs）。研究表明,tau蛋白的过度磷酸化是AD病程发展的早期事件,而且AD患者的临床痴呆程度与NFTs的数量密切相关。因此调节tau蛋白过度磷酸化为靶点的药物可能是防治AD的有效方法之一。肉毒碱（Carnitine）是赖氨酸的衍生物,其中左旋体具有生物学活性。本研究主要目的是探讨L-肉毒碱（L-Carnitine）在wotmannin（WT）及GF-109203 X（GFX）引起的AD样病理变化模型中的药理作用及其相关机制。我们给予50mg/只/天L-Carnitine溶于大鼠每日饮水中连续14天,在给药第8天时同时进行Morris水迷宫训练,在第15天给予大鼠侧脑室联合注射10μl浓度为100μM的PI3K特异性抑制剂wortmannin（WT）及PKC的特异性抑制剂GF-109203X（GFX）。侧脑室注射24h后进行Morris水迷宫测试检测大鼠空间记忆保留情况,之后取材进行免疫印迹及免疫组化检测。1.L-Carnitine可改善WT/GFX引起的空间记忆保留障碍结果显示:侧脑室注射WT/GFX24h后,大鼠找到隐藏平台的潜伏期明显延长,搜寻轨迹杂乱,而预先给予L-Carnitine的大鼠找到平台时间明显缩短,搜寻轨迹接近正常,表明预先给予L-Carnitine能有效改善由WT/GFX所致的大鼠空间记忆障碍。2. L-Carnitine可减轻WT/GFX引起的大鼠海马tau蛋白过度磷酸化免疫印迹结果显示:总tau蛋白水平,各个实验组无明显变化。侧脑室注射WT/GFX24h后tau蛋白磷酸化在Ser199/202、Thr205、Ser396及Ser404位点明显增强,预先给予L-Carnitine能减轻Ser199/202及Thr205位点的磷酸化水平,不能减轻Ser396及Ser404位点的磷酸化水平。Ser214位点tau蛋白磷酸化各个实验组无明显变化。免疫组织化学检测tau蛋白磷酸化及在海马分布情况,结果显示:L-Carnitine明显降低由于侧脑室注射WT/GFX24h后导致的PT205在大鼠海马各区的阳性染色,而增强Tau-1在海马CA3区的阳性染色。以上结果表明预先给予L-Carnitine能减轻WT/GFX导致的tau蛋白在PT205及Tau-1位点的过度磷酸化。3.L-Carnitine可减轻WT/GFX诱导的大鼠海马GSK-3β过度激活不依赖Akt激活为了探讨L-Carnitine减弱WT/GFX诱导的tau蛋白过度磷酸化的机制,研究发现注射WT/GFX后GSK-3β的非活性形式Ser9磷酸化的水平明显降低,预先给予L-Carnitine可增加GSK-3β的Ser9磷酸化水平,而总GSK-3β水平在各组均无明显变化,表明L-Carnitine能抑制WT/GFX所致的GSK-3β过度激活。Akt已被确定为是GSK-3β的上游调节因子,我们检测大鼠海马中AKT的Ser473磷酸化水平在注射WT/GFX后明显降低,给予L-Carnitine后不能使其水平升高。以上结果提示:WT/GFX激活GSK-3β,从而导致tau蛋白过度磷酸化和空间记忆障碍,L-Carnitine下调GSK-3β的活性而减轻tau蛋白的过度磷酸化及改善记忆是不依赖于Akt的激活。4.L-Carnitine增加c-Fos的表达从而提高记忆能力不是通过PKA/CREB通路实现的我们进一步研究了L-Carnitine对记忆保护的分子机制。我们用免疫组化检测大鼠海马内c-Fos的表达水平及分布,结果显示,注射WT/GFX的大鼠海马内c-Fos的表达明显较对照组有所降低,预先给予L-Carnitine能增加其表达,尤其在CA1, CA3及DG区最为明显。c-Fos是一种立早基因,它参与学习记忆的过程。以上结果表明:L-Carnitine提高学习记忆与增加c-Fos的表达有关。为了研究L-Carnitine增加c-Fos表达的上游机制,我们检测了PKA催化亚基及调节亚基和转录因子CREB的Ser133位点磷酸化水平。结果发现:各实验组PKA的催化亚基无明显差异,注射WT/GFX后导致PKA调节亚基显著增高,给予L-Carnitine不能逆转PKA调节亚基的水平。大鼠海马锥体细胞内CREB的Ser133位点磷酸化阳性着色在各个实验组无明显差异。以上结果提示: L-Carnitine增加c-Fos表达的不是通过PKA/CREB通路实现的。5. L-Carnitine对PP-2A催化亚单位酪氨酸307位点磷酸化的影响我们检测了PP-2A催化亚基总量（PP-2AC）和PP-2A催化亚单位Tyr307位点磷酸化（PP-2A的非活性形式）的水平。结果表明:各实验组之间PP-2AC未发生明显变化;PP-2A催化亚单位Tyr307位点的磷酸化水平在WT/GFX处理后无明显变化,而给与L-Carnitine后与对照组相比该位点磷酸化水平明显下降。提示L-Carnitine对tau蛋白过度磷酸化及空间记忆障碍的保护作用可能与其上调了PP-2A有关。
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