小球藻外源基因转化系统的建立及其表达植酸酶的研究

论文摘要

本文在国内外首次报道了植酸酶基因在海水小球藻（Chlorella sp.MACC/C95）中的稳定表达。以营养丰富的海水小球藻作为生物反应器来生产植酸酶,直接作为一种无毒无害的绿色饲料添加剂,可避免复杂的提纯分离工艺,具有广阔的开发前景和潜在的经济价值。本论文首先测定了海水小球藻对10种抗生素的敏感性,确定了小球藻基因工程适用的抗生素筛选标记。并以抗生素为除菌工具,获得了无菌的小球藻藻株,优化了无菌小球藻的培养条件。然后以无菌的海水小球藻完整细胞为受体,以gus基因作为报告基因,优化了电击转化条件。在此基础上,将植酸酶基因转入小球藻中,获得了转基因藻株。这不仅为低成本生产植酸酶,使其得以广泛应用,创造更大的经济效益和社会效益打下了基础,同时也为藻类生物反应器的建立及广泛应用开辟了道路。具体研究内容及结果如下: 1、研究了海水小球藻对10种常见抗生素的敏感性及淡化培养对小球藻生长的影响,并测定了潮霉素、G418、氯霉素、Zeocin对小球藻在海水培养基和淡化十倍培养基中的半致死剂量。实验结果表明,小球藻对卡那霉素、庆大霉素、新霉素、氨苄青霉素、头孢霉素、链霉素都不敏感,这几种抗生素在实验范围内不对小球藻的生长产生明显抑制;小球藻对潮霉素较敏感,对G418则很敏感,对氯霉素、Zeocin极敏感。淡化十倍培养对小球藻的生长没有显著影响,且能使小球藻对抗生素的敏感性大为提高。G418适合作为小球藻基因工程的选择试剂,其在固体培养基中的适宜筛选浓度为140.5μg/mL。 2、研究了以抗生素为除菌工具,建立小球藻无菌培养体系的途径。首先测定了小球藻培养液中的细菌对小球藻不敏感的6种抗生素的敏感性,然后研究了适于小球藻除菌的抗生素组合和处理浓度及加入抗生素对小球藻和细菌生长的影响。结果表明小球藻培养体系中的细菌对庆大霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、头孢霉素和链霉素非常敏感,利用涂平板挑单克隆法去除霉菌后,将这五种抗生素均以终浓度100μg/mL加入小球藻培养体系中,处理两次,获得了无菌的小球藻藻株。进一步研究了接种密度、光强、pH和温度对小球藻生长的影响,并在无菌培养条件下,对影响无菌小球藻生长的五种主要营养因素:NaHCO3、KNO3、K-H2PO4、VB1、VB12进行了优化。得到小球藻适宜的培养条件为:初始接种浓度取藻体细胞数为4.27×106个/mL左右;pH范围在10左右;培养温度为25±0.5℃;光照强度约为3.0×103～1.0×1041x。通过五因素四水平正交实验,得到适于无菌小球藻生长的优化培养基配方为:KNO30.5g/L、NaHCO30.2g/L、VB121.0μg/L、KH2PO40.02g/L、VB10.3mg/L。该优化配方加上f/2微量元素后具有

论文目录

• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 微藻概述
• 1.1.1 微藻的定义与分类
• 1.1.2 微藻的主要特点
• 1.1.3 微藻的应用价值
• 1.1.4 小球藻研究概况
• 1.2 微藻基因工程研究概况
• 1.2.1 蓝藻基因工程
• 1.2.1.1 蓝藻分子遗传学
• 1.2.1.2 蓝藻质粒及其载体系统
• 1.2.1.3 蓝藻基因转移系统
• 1.2.2 真核微藻基因工程
• 1.2.2.1 基因的研究
• 1.2.2.2 载体系统的研究
• 1.2.2.3 真核微藻的遗传转化
• 1.2.3 微藻基因工程应用前景及展望
• 1.2.3.1 利用基因工程培育优良藻种
• 1.2.3.2 利用藻类作为生物反应器生产有用产品
• 1.2.3.3 藻类天然产物的生产
• 1.2.3.4 藻类基因在农作物改良中的应用
• 1.3 植酸酶的研究进展及应用前景
• 1.3.1 植酸及植酸酶
• 1.3.1.1 植酸
• 1.3.1.2 植酸酶
• 1.3.1.3 植酸酶的基因工程
• 1.4 研究目的和意义
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究意义
• 参考文献
• 第二章 小球藻基因工程选择标记的确立
• 引言
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 藻种
• 2.1.1.2 培养基
• 2.1.1.3 主要试剂
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 培养方法
• 2.1.2.2 小球藻对10种抗生素敏感性的测定
• 2.1.2.3 淡化培养对小球藻生长的影响
• 2.1.2.4 4种抗生素对小球藻半致死剂量的测定
• 2.1.2.5 固体培养基中G418对小球藻生长的影响
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 小球藻对10种抗生素的敏感性
• 2.2.2 海水液体培养基中4种抗生素对小球藻半致死剂量
• 2.2.3 淡化液体培养中4种抗生素对小球藻半致死剂量
• 2.2.4 固体培养基中G418对小球藻生长的影响
• 2.3 讨论
• 2.3.1 小球藻对潮霉素的敏感性
• 2.3.2 小球藻对G418的敏感性
• 2.3.3 小球藻对氯霉素的敏感性
• 2.3.4 小球藻对Zeocin的敏感性
• 2.3.5 淡化培养时小球藻对抗生素的敏感性
• 2.3.6 G418在固体培养基中对小球藻生长的抑制
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第三章 小球藻无菌培养体系的建立
• 引言
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 藻种
• 3.1.1.2 主要试剂
• 3.1.1.3 培养基
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 培养方法
• 3.1.2.2 小球藻细胞数及培养液中细菌数的测量
• 3.1.2.3 小球藻培养液内的细菌对不同抗生素敏感性的测定
• 3.1.2.4 小球藻培养液除菌方法的建立
• 3.1.2.5 混合抗生素处理对小球藻和细菌生长的影响
• 3.1.2.6 小球藻干重的测量
• 3.1.2.7 小球藻细胞生长的测量
• 3.2 结果
• 3.2.1 小球藻培养液内细菌对不同抗生素的敏感性
• 3.2.2 小球藻无菌培养体系的建立
• 3.2.3 抗生素对小球藻细胞及其培养液中细菌的影响
• 3.2.4 培养条件对小球藻生长的影响
• 3.2.5 营养因素对小球藻生长的影响
• 3.3 讨论
• 3.3.1 抗生素除菌
• 3.3.2 pH值对小球藻生长的影响
• 3.3.3 接种量对小球藻生长的影响
• 3.3.4 光照强度对小球藻生长的影响
• 3.3.5 培养温度对小球藻生长的影响
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第四章 以gus基因优化小球藻电击转化的条件
• 引言
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 藻种
• 4.1.1.2 菌种与质粒
• 4.1.1.3 主要培养基
• 4.1.1.4 主要仪器
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 藻种培养
• 4.1.2.2 质粒DNA的提取
• 4.1.2.3 电击法转化小球藻的方法
• 4.1.2.4 GUS酶活的检测——荧光检测法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 GUS本底的定量测定
• 4.2.2 电击条件对转化效率的影响
• 4.2.3 生长时间对转化效率的影响
• 4.2.4 渗透处理对转化效率的影响
• 4.2.5 运载DNA浓度对转化效率的影响
• 4.2.6 质粒浓度对转化效率的影响
• 4.3 讨论
• 4.3.1 CaMV35S启动子对外源基因在小球藻中表达的作用
• 4.3.2 gus基因在小球藻中的瞬间表达
• 4.3.3 电击仪参数设置对小球藻转化率的影响
• 4.3.4 其它电击转化条件对小球藻转化率的影响
• 4.4 小结
• 参考文献
• 第五章 植酸酶基因在小球藻中的表达
• 引言
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 藻种
• 5.1.1.2 菌种与质粒
• 5.1.1.3 主要培养基
• 5.1.1.4 酶及试剂
• 5.1.1.5 主要仪器
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 构建pBI121/phyAⅡ的相关方法
• 5.1.2.2 植酸酶基因转化小球藻的方法
• 5.1.2.3 转化藻株的抗生素筛选
• 5.1.2.4 小球藻DNA的提取
• 5.1.2.5 转化藻株的PCR检测
• 5.1.2.6 转化藻株的Southern-blotting检测
• 5.1.2.7 小球藻总RNA的提取
• 5.1.2.8 转植酸酶基因小球藻藻株的RT-PCR检测
• 5.1.2.9 转植酸酶基因小球藻藻株的植酸酶活性和酶性质测定
• 5.2 结果
• 5.2.1 植酸酶基因表达载体的构建
• 5.2.2 转化藻株的抗生素筛选
• 5.2.3 转化藻株的PCR检测
• 5.2.4 转化藻株的PCR检测阳性率统计
• 5.2.5 转化藻株的PCR产物测序结果
• 5.2.6 转化藻株的Southern-blotting检测
• 5.2.7 转植酸酶基因小球藻藻株的RT-PCR检测
• 5.2.8 转植酸酶基因小球藻藻株的植酸酶活性检测
• 5.2.9 转植酸酶基因小球藻藻株的植酸酶性质测定
• 5.3 讨论
• 5.4 结论
• 参考文献
• 第六章 结论、创新点与后续研究工作展望
• 6.1 结论
• 6.2 创新点摘要
• 6.3 有待进一步开展的工作
• 6.4 展望
• 攻读博士学位期间发表及完成的学术论文
• 致谢
• 附录1
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