论文摘要
目的:利用除去间质细胞的骨髓细胞培养系(前破骨细胞形成系)及小鼠单核细胞RAW264.7细胞培养系分别诱导培养破骨前驱细胞及成熟破骨细胞,研究大黄酸对两种体外培养的破骨细胞形成及分化的影响,观察破骨细胞早期阶段及成熟阶段的形态学变化,为预防和治疗破骨细胞性骨吸收性疾病提供一种新制剂。方法:选用两种细胞培养系:除去间质细胞的骨髓细胞培养系(前破骨细胞形成系)及小鼠单核细胞RAW264.7细胞培养系,进行体外破骨细胞诱导培养,分别观察大黄酸对破骨前驱细胞及成熟破骨细胞形成、分化的影响。1细胞培养及药物添加:1.1前破骨细胞形成系:取4周龄SD雄性大鼠一只(80-120g),用异氟烷麻醉后,在无菌条件下取其胫骨和股骨,去掉骨垢端暴露骨髓腔,然后用10ml无菌注射器抽取不含血清的α-MEM培养液冲洗骨髓腔,制取全骨髓细胞,1500转/分离心5分钟后,弃去上清液,加入含15%胎牛血清的α-MEM培养液20ml,充分吹打混匀后形成单细胞悬液,此为全骨髓细胞悬液,经过离心浓缩成2ml,然后注入葡聚糖凝胶柱G10(Sephadex G10)中过滤,除去骨髓间质细胞,搜集非附着性骨髓细胞10-12ml,利用细胞计数板,计算细胞数,然后配制浓度为2×106cells/ml的细胞悬液13ml,添加破骨细胞分化因子(sRANKL)和活化型双羟维生素D3(1α,25(OH)2D3),使其终浓度分别为40ng/ml和10-8Mol/ml,将细胞悬液播种于24孔培养板中,每孔加入细胞悬液0.5ml(1×106cells)。然后将培养板放入37℃、5%CO2培养箱中培养,培养至第4天时更换培养液一次,共计培养7天。1.2小鼠单核细胞RAW264.7细胞培养系:从液氮罐中取出RAW264.7细胞株,放入37℃水浴箱中快速复苏,用无菌吸管将细胞液移至15ml离心管内,吸取生理盐水洗涤冻存管两次,一并将其移至上述离心管中,上离心机,1000转/分离心5分钟后,弃去上清液,加入含10%胎牛血清的1640培养液约10ml,充分吹打混匀形成单细胞悬液,根据实验要求培养细胞。当细胞生长状态良好,长满瓶底壁约90%时进行消化,收集细胞,1000转/分离心5分钟后,弃去上清液,加入含10%胎牛血清的1640培养液约10ml,充分吹打混匀形成单细胞悬液,利用细胞计数板,计算细胞数,然后配制成浓度为4.5×104cells/ml的细胞悬液5ml,添加破骨细胞分化因子(sRANKL)50ng/ml,播种细胞于96孔培养板中,利用24孔,共4行6列,每孔加入细胞悬液150μl,然后将培养板放入37℃、5%CO2培养箱中培养,培养45天。1.3药物添加:在4行6列的24孔培养板中添加药物大黄酸,使其终浓度分别为0、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L,每个浓度每列4孔(n=4),第一列为对照组。在96孔培养板中选择24个孔,使其呈4行6列,添加药物大黄酸,使其终浓度分别为0、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L,每个浓度每列4孔(n=4),第一列为对照组。2抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色:破骨前驱细胞培养系培养至第7天及RAW264.7细胞培养系培养至第5天后行TRAP染色,倒置光镜下观察,计算并记录染色阳性细胞数。3统计学分析:使用SPSS13.0软件进行统计学分析。数据处理采用mean±SD检验分析,数据资料采用Student’s t-test和非参数检验的方差分析,各不同浓度的加药组与对照组之间相比较。结果:1前破骨细胞形成系:1.1破骨前驱细胞的形态学特征经TRAP染色后,可见到大量染色阳性的破骨前驱细胞,其形态学特征与成熟破骨细胞相似,但是细胞体积较小,形态多样(见Fig.1),可呈椭圆形、类圆形、四边形、条索状和不规则形等。细胞大多为单核,也可见到2核者。1.2大黄酸对破骨前驱细胞形成的抑制在前破骨细胞形成系中,10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L组与对照组相比,TRAP染色阳性细胞(单核或2核)数仅为对照组的4.98%、12.27%、18.57%、34.14%、78.57%。经统计学分析,加药组对破骨前驱细胞的形成有抑制作用,当药物浓度为10-3mol/L时,与对照组相比,对破骨前驱细胞的形成有显著抑制(p﹤0.05)(见Fig.3和Table1)。2RAW264.7细胞培养系:2.1破骨细胞样细胞(成熟破骨细胞)的形态学特征经TRAP染色后,可见到大量破骨细胞样细胞,其形态学特征与成熟破骨细胞相似,细胞体积较大,形态多样(见Fig.5),可呈星形、圆形、类圆形、梭形、条索状及不规则形。细胞核为多个。2.2大黄酸对破骨细胞样细胞形成的抑制在RAW264.7细胞培养系中,10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L组与对照组相比,TRAP染色阳性细胞数仅为对照组的4.36%、63.39%、72.73%、81.94%、92.73%。经统计学分析,加药组对破骨细胞样细胞的形成有抑制作用,当药物浓度为10-3mol/L时,与对照组相比,对破骨细胞样细胞的形成有显著抑制(p﹤0.05)(见Fig.6和Table2)。结论:1大黄酸能抑制破骨前驱细胞及成熟破骨细胞的形成与分化。2大黄酸对破骨细胞的抑制作用在一定浓度范围内具有浓度依赖性。
论文目录
相关论文文献
- [1].赖氨大黄酸盐的合成工艺及活性研究[J]. 中国现代应用药学 2010(11)
- [2].通便灵片中大黄酸含量的测定[J]. 山东医药 2011(13)
- [3].大黄酸酰胺衍生物的连续化合成研究[J]. 广州化工 2018(09)
- [4].大黄酸对胰岛素信号通路及其负性调控蛋白蛋白酪氨酸磷酸酶1B的影响[J]. 医学研究生学报 2018(07)
- [5].大黄酸在小鼠体内的药代动力学及组织分布研究[J]. 中药药理与临床 2018(04)
- [6].赖氨大黄酸减轻D-半乳糖致衰老小鼠肝脏损伤[J]. 基础医学与临床 2015(04)
- [7].微波辐射下6-烷氧基大黄酸的合成及抑菌活性研究[J]. 有机化学 2010(09)
- [8].新型6-烷氧基大黄酸-氨基酸加合物的合成及抗肿瘤活性[J]. 合成化学 2019(02)
- [9].大黄酸对小鼠肾脏的毒性机制[J]. 中国实验方剂学杂志 2019(11)
- [10].大黄酸兔源多克隆抗血清的制备与鉴定[J]. 中国中医药信息杂志 2018(05)
- [11].含酰胺结构的大黄酸衍生物4a对卵巢癌细胞的迁移、侵袭的影响[J]. 中国药理学通报 2020(02)
- [12].大黄酸增强低氧环境中效应T细胞的抗结肠癌活性[J]. 中国中西医结合外科杂志 2018(04)
- [13].大黄酸硝酸酯衍生物的设计、合成及抗肿瘤活性[J]. 化学世界 2018(11)
- [14].大黄酸对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏病理组织学及超微结构变化的影响[J]. 中国中医药科技 2013(05)
- [15].大黄酸衍生物的合成及其抑菌活性研究[J]. 林产化学与工业 2018(02)
- [16].大黄酸及大黄酸铜配合物与脱氧核糖核酸的相互作用[J]. 石河子大学学报(自然科学版) 2018(02)
- [17].赖氨大黄酸通过调控miRNA表达水平抑制HBV增殖[J]. 检验医学与临床 2015(19)
- [18].大黄酸精氨酸预防大鼠实验性肠粘连抗炎机制的研究[J]. 中药新药与临床药理 2010(01)
- [19].大黄酸胺基醇酯衍生物的合成及其抗骨肉瘤细胞活性[J]. 药学学报 2018(02)
- [20].大黄酸对内毒素激活小胶质细胞的影响[J]. 天津中医药大学学报 2012(01)
- [21].梓醇配伍大黄酸对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠大脑内髓鞘碱性蛋白的影响[J]. 中华中医药杂志 2018(03)
- [22].大黄酸及其衍生物:合成与药理作用研究进展[J]. 药学研究 2016(03)
- [23].赖氨大黄酸对HeLa细胞周期的影响及其机制[J]. 中国现代应用药学 2011(06)
- [24].大黄酸抑制气道平滑肌收缩机制研究[J]. 江汉大学学报(自然科学版) 2019(02)
- [25].1,8-二乙酰基大黄酸-(2-溴)-乙酯的合成及对骨肉瘤MG-63细胞的作用研究[J]. 中国药理学通报 2018(01)
- [26].大黄酸通过抑制ERK途径诱导胶质瘤细胞增殖分化的实验研究[J]. 临床神经外科杂志 2018(04)
- [27].HPLC-荧光检测法测定人血大黄酸的药代动力学和相对生物利用度[J]. 北方药学 2016(08)
- [28].大黄酸的稳定性研究[J]. 中国药业 2015(16)
- [29].大黄酸及其偶联物药理活性的研究进展[J]. 中国药业 2011(15)
- [30].大黄酸分散体对db/db小鼠肾脏病理损伤的抑制作用[J]. 临床合理用药杂志 2019(28)