拟南芥CEO2基因功能的分子遗传学分析

论文摘要

多种非生物胁迫包括重金属污染都能诱导植物体内活性氧的产生,活性氧具有双重作用,一方面对细胞产生毒害作用;另一方面作为重要的信号分子还参与了植物的生长发育、胁迫应答等重要的生理过程。目前已经鉴定出了许多活性氧信号转导途径中的组分,但对活性氧在细胞伤害和基因表达调控的分子机制方面仍缺乏足够的了解。本研究对拟南芥一个可能的转录调节因子CEO2功能及其介导重金属伤害的分子机制进行了分析。通过生物信息学分析发现,CEO2与CEO1具有65.0%的相同和72.3%的相似性,序列分析表明具有三个富含精氨酸（R）和赖氨酸（K）的区域,即核定位信号（NLS）。利用PCR技术筛选和分离到了CEO2的T-DNA插入纯合突变体,半定量基因转录分析表明,ceo2-1中CEO2表达明显低于野生型。GUS组织化学分析发现CEO2主要在代谢比较旺盛的部位如幼苗、柱头及其花药等组织表达,CEO2可能定位于细胞核。在正常生长条件下,ceo2-1突变植株与野生型在生长发育,种子萌发等方面没有明显的区别。但在HgCl2和H2O2处理下,与野生型相比ceo2-1植株生长受到明显抑制,出现黄化、真叶减少等现象,电导率的检测表明,突变体的细胞膜破坏比较严重。利用DAB染色和激光共聚焦显微成像技术研究证明,突变体在重金属胁迫下积累更多的H2O2,推测CEO2缺失可能影响植物体内的H2O2信号传递以及清除功能。同时,利用酵母双杂交和GST Pull-down实验证实,CEO2可与氧化胁迫的感受和传递蛋白GPX3发生相互作用。通过定量RT-PCR分析表明,在氧化和重金属胁迫下,ceo2-1中一些与非生物胁迫相关的基因如APX1、RD29的表达明显受到抑制。上述的研究结果说明了CEO2可能位于H2O2感受子的下游,可能调控了细胞H2O2代谢和基因表达,在植物对于重金属胁迫的应答过程中有重要的作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一部分 引言
• 第一章 植物对重金属胁迫反应的分子基础
• 1 植物对重金属的解毒机制
• 1.1 植物螯合肽
• 1.1.1 PC的解毒机制
• 1.1.2 LMW与HMW复合物
• 1.1.3 螯合肽合酶基因
• 1.2 金属硫蛋白和类金属硫蛋白（MT-like）
• 1.3 抗氧化系统及其防御机制
• 2 植物对重金属反应的信号转导过程
• 3 重金属污染的植物修复及超富集植物研究
• 3.1 植物治理
• 3.2 超富集植物
• 4 展望
• 第二章 活性氧及氧化胁迫概述
• 1 活性氧概述
• 1.1 活性氧的产生
• 1.1.1 光合作用与活性氧产生
• 1.1.2 线粒体与活性氧产生
• 1.2 活性氧的清除
• 2 氧化胁迫概述
• 2.1 质膜损伤
• 2.2 细胞死亡
• 2.3 激活防卫反应基因表达
• 3 ROS信号转导途径
• 3.1 细菌中ROS信号转导
• 3.2 酵母中活性氧信号转导途径
• 3.3 植物中活性氧的信号转导途径
• 2O₂作为重要的活性氧分子广泛参与植物对胁迫条件的反应'>3.4 H₂O₂作为重要的活性氧分子广泛参与植物对胁迫条件的反应
• 4 拟南芥AtCEO1的研究进展
• 5 展望
• 第三章 研究的目的和意义
• 第二部分 研究报告
• 第四章 AtCEO2 T-DNA插入突变体的鉴定及表型分析
• 一、前言
• 二、材料和方法
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 工具酶及试剂盒
• 1.3 实验仪器
• 1.4 PCR引物
• 1.5 常用培养基和抗生素
• 2 实验方法
• 2.1 植物材料种植
• 2.2 生物信息学分析方法
• 2.3 小量基因组DNA提取方法
• 2.4 PCR鉴定突变体纯合植株
• 2.5 总RNA提取（Trizol法）
• 2.6 mRNA的反转录
• 2.7 半定量RT-PCR
• 2.8 各种处理的表型观察
• 2.9 离子的电渗漏检测
• 三、实验结果
• 1 AtCEO2生物信息学分析
• 2 T-DNA插入突变体的鉴定和纯合体的筛选
• 3 各种非生物胁迫对atceo2-1生长的影响
• 3.1 atceo2-1突变体对重金属汞敏感
• 2O₂敏感'>3.2 atceo2-1对H₂O₂敏感
• 3.3 重金属胁迫破坏了细胞膜结构的完整性
• 四、讨论
• 第五章 AtCEO2表达、定位及对重金属反应的机制
• 一、前言
• 二、材料和方法
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料和菌株
• 1.2 质粒载体
• 1.3 实验试剂
• 1.4 实验仪器
• 1.5 培养基
• 1.6 PCR引物
• 2 实验方法
• 2.1 植物材料的种植
• 2.2 丙二醛的测定
• 2.3 叶片半薄切片的制作
• 2.4 超薄切片制作
• 2O₂'>2.5 DAB染色原位检测H₂O₂
• 2.6 NBT染色原位检测超氧阴离子
• 2O₂的产生'>2.7 激光共聚焦显微检测技术测定H₂O₂的产生
• 2.8 β-葡糖苷酸酶的组织化学鉴定
• 2.9 AtCEO2 cDNA全长序列的扩增
• 2.10 PCR产物的回收和纯化
• 2.11 重组质粒构建
• 2.12 重组质粒对E.coli的转化
• 2.13 农杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.14 转基因植物的筛选
• 2.15 AtCEO2亚细胞定位方法
• 三、实验结果
• 1 拟南芥AtCEO2 cDNA克隆与鉴定
• 1.1 总RNA的质量鉴定
• 1.2 拟南芥AtCEO2启动子克隆及pCMBIA1381-GUS融合表达载体的构建与鉴定
• 1.3 AtCEO2组织表达分析
• 2 AtCEO2的亚细胞定位
• 2.1 pEGAD-GFP-AtCEO2重组质粒构建与鉴定
• 2.2 AtCEO2的GFP定位
• 2胁迫条件下诱导atceo2-1突变体ROS产生'>3 HgCl₂胁迫条件下诱导atceo2-1突变体ROS产生
• 4 重金属胁迫对atceo2-1叶绿体结构的影响
• 四、讨论
• 1 AtCEO2基因可能参与了重金属汞诱导的氧化胁迫的应答
• 2诱导的氧化胁迫引起的细胞伤害'>2 AtCEO2基因可能参与了HgCl₂诱导的氧化胁迫引起的细胞伤害
• 3 AtCEO2蛋白表达定位于细胞核
• 第六章 AtCEO2调控氧化信号转导及相关基因的表达
• 一、前言
• 二、材料和方法
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 试验仪器
• 1.3 试剂和溶液
• 1.4 Real-time PCR引物
• 2 实验方法
• 2.1 Real-time PCR分析
• 2.2 酵母双杂交操作方法
• 三 实验结果
• 1 AtCEO2和AtGPX3在酵母中的相互作用
• 2 AtCEO2对抗坏血酸过氧化物酶（APX1）表达的影响
• 2.1 APX1 Real-time PCR引物的验证
• 2.2 atceo2-1中APX1的表达情况
• 2.3 atceo2-1中其他基因的表达情况
• 四 讨论
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢