假单胞菌抗生素：吩嗪类化合物的检测与藤黄绿菌素的土壤残留分析

论文摘要

假单胞菌（Pseudomonas）是广泛存在的一种革兰氏阴性细菌,可生物合成藤黄绿菌素（Pyoluteorin,Plt）与多种吩嗪类化合物,如吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-Carboxylic Acid,PCA)、绿脓菌素（Pyocyanin,PYO）、1-羟基吩嗪（1-hydroxyphenazine,1-OH-PHZ）等,这些化合物都具有广谱抑菌活性,对这些化合物的快速检测有利于进一步研究与监控Plt与吩嗪类化合物的动态合成过程,但目前缺少一种快速、准确、高灵敏度的检测方法来同时检测上述化合物。本研究采用反相HPLC技术,以25 mM乙酸铵-乙腈为流动相进行梯度洗脱,可快速检测PCA、PYO、1-OH-PHZ与Plt等物质,样品最长保留时间为7.788 min、8.227 min、12.045 min和11.515 min。PCA、PYO、1-OH-PHZ与Plt在该方法下的最低检出限分别为6.347 ng.mL-1、78.74 ng.mL-1、9.173 ng.mL-1、117.2 ng.mL-1。同时利用该方法对荧光假单胞菌Pf-5、铜绿假单胞菌PAO1、绿针假单胞菌GP72与假单胞菌M18的发酵产物包括2-OH-PHZ、2-OH-PCA等,成功进行了定量检测,为吩嗪类化合物的合成途径研究和新吩嗪类物质的鉴定奠定良好的基础。假单胞菌抗生素中PCA与Plt是最具应用价值的新型生物农药,具有抑制细菌、真菌、除草等功能,应用前景广阔。随着现今社会对环境保护的重视程度逐渐提高,土壤中农药残留带来的污染也引起广泛关注。目前对PCA的土壤残留分析已有报道,但Plt尚无此报道,因此建立一种能快速准确地检测土壤中Plt残留的分析方法是十分必要的。本研究利用超声和索氏提取,建立了一种高效回收土壤中Plt的方法。结果表明,土壤中的Plt浓度在0.050.5mg.kg-1之间时,回收率在78.25%94.18%,达到农药残留分析的要求。结合场放大样品堆积毛细管电泳技术对Plt残留进行检测,相比于已报道的液相色谱检测方法与毛细管区带电泳检测方法,Plt的最低检出限分别提高93倍和6倍,为0.107μg.mL-1;相比于本研究建立的反相HPLC检测方法具有更快的检测速度,Plt保留时间约为6.3 min。同时测定了Plt在土壤中残留的动态变化曲线,计算得到Plt在地表土壤和根际土壤中的半衰期分别为42.26小时和32.84小时,具有较大的降解速率,表明Plt作为一种潜在的生物农药,具有很好的生物安全性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 生物农药概述
• 1.1.1 生物农药的定义和分类
• 1.1.2 生物农药的优缺点
• 1.2 假单胞菌及其抗生素
• 1.2.1 植物根际促生细菌和假单胞菌
• 1.2.2 假单胞菌抗生素概述
• 1.3 抗生素分析方法
• 1.3.1 分析方法概述
• 1.3.2 分析方法的研究现状
• 1.3.3 高效液相色谱
• 1.3.4 毛细管电泳
• 1.4 农药残留分析
• 1.4.1 农药在土壤中的行为
• 1.4.2 农药残留的相关概念
• 1.4.3 农药残留分析方法
• 1.4.4 索氏提取技术
• 1.5 工作背景和意义
• 第二章 吩嗪类化合物的分析检测
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 标准液与缓冲液配制
• 2.1.4 活性物质提取与检测
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 HPLC 流动相的选择
• 2.2.2 HPLC 检测方法
• 2.2.3 发酵液萃取剂的选择
• 2.2.4 菌株发酵液分析
• 2.3 总结
• 第三章 Plt 的土壤中残留分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 标准液与缓冲液配制
• 3.1.4 Plt 与PCA 样品制备
• 3.1.5 土壤提取方法
• 3.1.6 毛细管电泳检测
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 土壤提取步骤
• 3.2.2 场放大样品堆积毛细管电泳检测
• 3.2.3 Plt 的土壤残留检测
• 3.3 总结
• 第四章 总结与展望
• 4.1 主要结论
• 4.2 研究展望
• 参考文献
• 致谢