珙桐叶片cDNA文库构建

论文摘要

珙桐为第三纪古热带植物区系的孑遗种,为国家一级保护珍稀濒危植物,也是世界著名的观赏木本花卉。到目前为止,关于珙桐宏观研究的报道已有许多,但是关于珙桐分子方面的基础研究相对缺乏。为了探讨珙桐含有的特有种属基因,保存珙桐的资源信息库,本论文实验构建了珙桐叶片组织全长cDNA文库,并对文库的质量进行了初步鉴定。本论文实验以珙桐叶片为研究材料,采用Trizol法和Rneasy Plant Mini Kit法提取珙桐叶片组织总RNA,检测结果表明用Rneasy Plant Mini Kit法提取的效果较好。基于此结果本实验用Rneasy Plant Mini Kit法提取珙桐叶片总RNA为SMART TM cDNA Library Construction Kit的起始材料合成全长cDNA并连接到λTriplEx2载体上,Gigapack（?）ⅢGold Packaging包装重组λDNA。包装好的噬菌体颗粒侵染E. coli XL1-Blue、BM25.8大肠杆菌,成功构建了珙桐叶片组织的cDNA文库。珙桐叶片总RNA反转录成单链cDNA,长距离PCR方法合成双链cDNA;PCR产物经蛋白酶K消化后,用SfiI酶切；将酶切产物进行分级分离,回收0.5kb以上的cDNA组分,并与λTriplEx2载体连接；连接产物经体外蛋白包装,产生原始文库；鉴定文库的滴度和重组效率后,进行文库扩增和保存。随机挑取40个噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量。经测定该文库初始滴度为6.3×106pfu/ml,重组率为97.4%；扩增后滴度为5.16×107pfu/ml;插入片段长度为0.4～2.0kb。由于反转录过程中采用附加序列的方法使全长mRNA得到反转录,所以得到的cDNA是完整的,完全符合cDNA文库的要求。通过对cDNA文库的质量检测,文库中插入片段长度的长度、文库的滴度以及重组率都符合cDNA文库的要求。珙桐叶片λ噬菌体cDNA文库的成功构建,为进一步开展珙桐EST文库构建及目的基因克隆功能基因组研究奠定了物质基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 珙桐的概况
• 1.1.1 珙桐的生物学特征
• 1.1.2 珙桐的天然分布及濒危原因
• 1.1.3 珙桐的国内外研究进展
• 1.2 cDNA文库概况
• 1.2.1 构建cDNA文库的新方法
• 1.2.2 cDNA文库的分类
• 1.2.3 cDNA文库的应用
• 1.2.4 构建理想cDNA文库考虑的因素
• 1.3 本研究的立题依据
• 1.3.1 目的意义
• 1.3.2 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 溶液及培养基配制
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 珙桐叶片总RNA的提取
• 2.2.2 cDNA的合成
• 2.2.3 连接反应
• 2.2.4 包装反应
• 2.2.5 文库质量鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 珙桐总RNA的浓度和质量检测
• 3.1.1 采用Trizol法提取珙桐总RNA的浓度和质量检测
• 3.1.2 采用Rneasy Plant Mini Kit法提取珙桐总RNA的浓度和质量检测
• 3.2 cDNA文库构建及质量检测
• 3.2.1 双链cDNA的合成和鉴定
• 3.2.2 cDNA的分级分离
• 3.2.3 cDNA与载体连接效率及未扩增文库滴度测定
• 3.2.4 文库的重组率
• 3.2.5 扩增文库滴度和库容量测定
• 3.2.6 文库的PCR鉴定
• 4 讨论
• 4.1 关于珙桐叶片总RNA提取
• 4.1.1 总RNA提取过程应注意的问题
• 4.1.2 利用总RNA为起始材料构建cDNA文库
• 4.2 关于cDNA文库的构建
• 4.2.1 关于cDNA的合成
• 4.2.2 关于cDNA的分级分离
• 4.2.3 关于噬菌体颗粒构建
• 4.2.4 λ噬菌体平板培养
• 4.3 关于cDNA文库的质量
• 4.3.1 cDNA文库质量评价
• 4.3.2 cDNA文库构建技术的优化
• 4.4 cDNA文库构建后续工作
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢