黄灰青霉纤溶酶的分离纯化及部分酶学性质的研究

论文摘要

纤溶酶是具有纤溶活性丝氨酸蛋白的一种,不但可直接溶解纤维蛋白,抑制血栓形成,而且具有抗血小板聚集,增强纤溶作用的功能。与目前临床所用的尿激酶、链激酶等溶栓药物相比,具有安全性好,易被人体吸收,作用直接迅速,药效持续时间长,成本低等优点,具有开发成为新一代溶栓药物或相关功能性食品的潜力。论文利用本实验室首次报道的高产纤溶酶黄灰青霉菌株为发酵菌株,对其所产纤溶酶进行分离纯化以及部分酶学性质的研究,研究结果如下:1、通过硫酸铵盐析曲线,确定采用20%饱和度的硫酸铵盐析除去部分杂蛋白,再用60%的饱和度盐析得粗酶样品。采用含10mmol/L NaCl,80mmol/L NaCl洗脱溶液,阶段洗脱的方法进行CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析。10mmol/L磷酸洗脱液进行Sephadex G-100凝胶过滤层析,进一步纯化蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳检测为单一条带,其分子量为15kDa,酶活回收率为10.5%,纯化倍数为29.6。2、研究纤溶酶溶液的热稳定性和pH对酶活力的影响,结果表明:该酶最适作用温度为41℃,纤溶酶在30℃～41℃范围内,随温度的升高,酶反应速度加快,酶活力升高;当温度在41℃时,酶活力达到最高值;当温度大于41℃时,该酶随温度的升高,酶反应速度减慢,酶活力迅速下降。该酶最适作用pH为8.8,环境pH7.8～9.8时酶活稳定,在此范围内酶活力保存85%以上,说明该酶是一种偏碱性蛋白酶。当pH小于7.8或pH大于9.8的条件下,该酶活力迅速下降。3、研究金属离子对纤溶酶活力的影响,结果表明:K+和Mg2+离子对酶活力影响不大,Fe2+和Mn2+离子对酶活力有明显的抑制作用,Ca2+离子对酶活力有明显的激活作用。4、研究化学物质对纤溶酶活力的影响,结果表明:化学物质具有稳定酶活力的作用。该作用由强至弱的顺序为:牛血清白蛋白＞蔗糖＞甘油＞Tween-80＞蛋白胨,其中以牛血清蛋白、蔗糖的效果最为显著。5、研究蛋白酶抑制剂对酶活力的影响,结果表明:PMSF对纤溶酶有明显的抑制作用,并且随着抑制剂浓度的增加,抑制作用增大,说明该酶是一种丝氨酸蛋白酶。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 溶栓剂的溶栓机理
• 1.2 溶栓剂的研究历史
• 1.3 纤溶酶的研究进展
• 1.4 本研究创新点
• 第二章 纤溶酶的分离纯化
• 2.1 前言
• 2.2 试验材料
• 2.3 试验方法
• 2.4 结果与分析
• 2.5 本章小结
• 第三章 纤溶酶部分酶学性质的研究
• 3.1 前言
• 3.2 试验材料
• 3.3 试验方法
• 3.4 结果与分析
• 3.5 本章小结
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢