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RSV重组蛋白疫苗的制备及其免疫原性和保护性研究

2020-11-23阅读(224)

RSV重组蛋白疫苗的制备及其免疫原性和保护性研究

论文摘要

呼吸道合胞病毒（RSV）是婴幼儿下呼吸道感染的最重要病原，也是造成老年人和免疫缺陷成人高患病率和死亡率的重要原因。60年代研制的福尔马林灭活的RSV（FI-RSV）免疫幼儿后，不仅没达到预防目的，反而使其自然感染RSV后病情加重，造成80％被免疫者住院，其中2例死亡。目前认为FI-RSV疫苗导致的病情加剧与伴随肺部嗜酸性粒细胞浸润和IL-4、IL-5细胞因子升高的Th2型优势应答、中和抗体水平不足、以及缺乏局部免疫等有关。WHO已将RSV疫苗列为优先发展的疫苗之一，但由于疫苗导致的免疫病理学和安全性问题，目前仍无一例安全有效的疫苗被批准上市。 大量研究发现RSV的G蛋白免疫小鼠后能诱导以IgG1为主的抗体和Th2优势应答，但不能诱导IgG2a、Th1和MHC I限制性CD8+T细胞应答，这种免疫的不平衡性与该类蛋白疫苗的副作用密切相关。研究发现：在诱导CD4+T细胞的同时激活CD8+T细胞可以下调Th2型细胞因子，同时防止嗜酸性粒细胞浸涧，可见CD8+T细胞不仅在清除RSV，而且在下调Th2型细胞因子应答和控制Th2型优势应答导致的病理反应中均起着重要的作用。 一个理想的、安全有效的RSV疫苗应该能够同时诱导体液免疫（抗体）、细胞免疫（CTLs）和平衡的Th1／Th2应答。本论文所描述的重组融合蛋白G：125-225-F／M2：81-95（G1F／M2），包括G蛋白的中和抗体表位片段（G：125-225）和RSV-M2蛋白的CD8+T细胞表位片段（M2：81-95）；其设计目标是发展一个安全有效的RSV疫苗。 首先构建表达质粒并表达纯化融合蛋白G1F／M2：将G1和F／M2：81-95基因片段插入质粒pET-DsbA中构建了原核表达质粒，在E.coli BL21（DE3）中得到表达，采用Ni+螯合亲和层析法纯化尿素变性的包涵体溶液，梯度透析复性，Western-blot鉴定重组蛋白的RSV特异性，用凝血酶切割DsbA-G1F／M2而得到融合蛋白G1F／M2。 免疫原性研究：将融合蛋白G1F／M2以铝盐为佐剂腹腔注射免疫BALB／c小鼠，或将G1F／M2与佐剂型载体热休克蛋白HSP70L1形成的复合物HSP70L1-G1F／M2（HSP-G1F／M2）皮下注射免疫BALB／c小鼠，均诱导了高滴度的蛋白及RSV特异

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 缩略语表
  • 引言
  • 1 RSV的一般生物学特性和流行病学
  • 2 防治RSV感染的抗体药物
  • 3 预防RSV感染的疫苗的研究
  • 3.1 免疫病理学研究
  • 3.2 疫苗的研究进展
  • 4 佐剂
  • 4.1 概述
  • 4.2 HSPs是一类高效佐剂
  • 5 本课题的设计思路
  • 5.1 RSV重组蛋白疫苗的设计
  • 5.2 HSP是重组蛋白疫苗的理想佐剂
  • 6 本研究的技术路线：
  • 第一部分 RSV重组蛋白疫苗的质粒构建、表达及纯化
  • 第一节 pET-DsbA-G1F／M2质粒的构建、表达及纯化
  • 1 实验材料
  • 2 实验方法
  • 3 实验结果
  • 第二节 pET-DsbA-G1LF／M2质粒的构建、表达及纯化
  • 1 实验材料
  • 2 实验方法
  • 3 实验结果
  • 第三节 pET-G1F／M2质粒的构建、表达及纯化
  • 1 实验材料
  • 2 实验方法
  • 3 实验结果
  • 第四节 蛋白DsbA-G1和G1的表达纯化
  • 1 实验材料
  • 2 实验方法
  • 3 实验结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 第二部分 RSV重组蛋白疫苗的免疫原性研究
  • 第一节 重组蛋白在BALB／c小鼠体内诱导了强烈的体液免疫和细胞免疫
  • 1 实验材料
  • 2 实验方法
  • 3 实验结果
  • 讨论
  • 第二节 F／M2与G1的融合表达对G1诱导的免疫应答的调节作用
  • 1 实验材料
  • 2 实验方法
  • 3 实验结果
  • 讨论
  • 第三节 RSV重组蛋白疫苗G1F／M2在BALB／c小鼠体内诱导了平衡的免疫应答
  • 1 实验材料
  • 2 实验方法
  • 3 实验结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 第三部分 RSV重组蛋白疫苗G1F／M2的保护性和安全性研究
  • 1 实验材料
  • 2 实验方法
  • 3 实验结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 第四部分 HSP70L1的克隆、表达及作为G1F／M2佐剂的初步研究
  • 第一节 HSP70L1基因的克隆、质粒的构建、表达及纯化
  • 1 实验材料
  • 2 实验方法和结果
  • 第二节 HSP-G1F／M2复合物的免疫原性和保护性研究
  • 1 实验方法
  • 2 实验结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 全文总结
  • 本课题的特色和创新之处
  • 致谢
  • 附录 在学期间发表的论文
  • 个人简历
  • 文章 Induction of Balanced Immunity in BALB／c Mice by Vaccination with a Recombinant Fusion Protein Containing a Respiratory Syncytial Virus G Protein Fragment and a CTL Epitope

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