乙酰羟酸合成酶分子体外筛选模型的构建及其与除草剂的相互作用

论文摘要

乙酰羟酸合成酶（AHAS）是一个广泛存在于植物和微生物体内诱导支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸合成的关键性酶。已经证实它为多种除草剂靶酶,如目前广泛使用的除草剂磺酰脲类和咪唑啉酮类。本研究从植物拟南芥叶片中克隆了乙酰羟酸合成酶催化亚基基因,用大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统表达了乙酰羟酸合成酶催化亚基,并研究了表达产物的活性被除草剂的抑制作用,并用荧光法研究乙酰羟酸合成酶与氯嘧磺隆、咪草烟和单嘧磺隆中间体的相互作用。主要研究结果如下:（1）从拟南芥叶片中提取总RNA,根据已报道的拟南芥AHAS序列（NM 114714）,利用RT-PCR技术扩增,获得了包含乙酰羟酸合成酶催化亚基基因的DNA片段（GenBank接受号:DQ991161）,此片段包含一个2013 bp的读码框（编码670个氨基酸）,与参考序列（NM 114714）比对,发现本研究所克隆的乙酰羟酸合成酶催化亚基基因序列与NM 114714的氨基酸序列同源性高达99%。（2）利用SalⅠ和NotⅠ位点,将本研究所克隆的拟南芥乙酰羟酸合成酶催化亚基基因（去除前85个氨基酸的导肽序列）克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a（+）,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,以融合形式进行蛋白表达。经SDS-PAGE分析表明,在69 KDa附近获得了预期的表达条带,且表达产物在大肠杆菌中以包涵体形式存在。（3）利用NotⅠ位点将本研究所克隆的拟南芥乙酰羟酸合成酶催化亚基基因克隆入酵母表达载体pPIC9K,将经过PCR和酶切同时鉴定获得的正向连接重组子转化入酵母菌株GS115,筛选（Mut+）重组子并用甲醇诱导表达,获得了预期的AHAS表达条带（72 kDa左右）,表达产物以分泌形式表达。产物表达时相分析表明,在诱导72小时后表达量最高。（4）将利用大肠杆菌表达的拟南芥乙酰羟酸合成酶催化亚基包涵体在变性条件下用镍柱纯化,再经稀释法复性,进行活性测定,测得酶活值为1.18×10-8μmol/min,酶比活值为1.31μmol /mg·min。将利用毕赤酵母表达的拟南芥乙酰羟酸合成酶催化亚基进行粗酶活性测定,表明酶活值为1.11×10-8μmol/min,比活性为0.59μmol/mg·min。（5）利用荧光光谱法研究了溶液状态下乙酰羟酸合成酶与除草剂氯嘧磺隆（简称CE）、咪草烟（IQ）和农药单嘧磺隆中间体的相互作用。确定了乙酰羟酸合成酶的荧光峰,结果表明CE和IQ对AHAS静态荧光猝灭,推测CE、IQ与AHAS之间能够形成复合物,主要为疏水作用,37℃下的猝灭常数Kq分别为4.73×1012和1.16×1012,结合位点数分别为1.0649和1.3813,表明CE与AHAS 1:1结合,IQ与AHAS 1:1结合或1:2结合。根据F（o|¨）rster非辐射能量转移理论得到CE与AHAS之间的结合距离为0.2972 nm（37℃）,IQ与AHAS之间的结合距离为0.399 nm（37℃）而农药单嘧磺隆中间体不能与乙酰羟酸合成酶相互作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 抑制支链氨基酸生物合成途径除草剂靶标的研究进展
• 1.2 利用生物大分子筛选与其作用的活性小分子研究进展
• 1.2.1 利用生物大分子筛选与其作用的活性小分子的方法
• 1.2.2 药物与生物大分子相互作用研究进展
• 1.3 除草剂与拟南芥乙酰羟酸合成酶ATAHAS 相互作用的分子机理研究进展
• 1.3.1 AtAHAS 的结构
• 1.3.2 磺酰脲与咪唑啉酮对AtAHAS 的作用
• 1.4 研究目的和实验内容
• 1.4.1 研究的目的和意义
• 1.4.2 课题来源和研究内容
• 2 实验材料和仪器
• 2.1 供试材料
• 2.2 基本试剂及生产厂家
• 2.2.1 拟南芥乙酰羟酸合成酶催化亚基的基因克隆与序列分析材料
• 2.2.2 乙酰羟酸合成酶催化亚基在大肠杆菌中的表达材料
• 2.2.3 毕赤酵母表达系统的构建材料
• 2.2.4 酶活测定与荧光分析材料
• 2.3 培养基及溶液
• 2.4 仪器与厂家
• 3 实验方法
• 3.1 拟南芥乙酰羟酸合成酶催化亚基的基因克隆与序列分析
• 3.1.1 总RNA 提取方法
• 3.1.2 总 RNA 质量检测
• 3.1.3 乙酰羟酸合成酶催化亚基cDNA 的合成
• 3.1.4 乙酰羟酸合成酶催化亚基cDNA 的扩增
• 3.1.5 PCR 产物的纯化
• 3.1.6 JM 109 感受态细胞制备
• 3.1.7 目的基因与克隆载体的连接及转化
• 3.1.8 阳性克隆的鉴定
• 3.1.9 目的基因的核苷酸序列测定
• 3.2 乙酰羟酸合成酶催化亚基在大肠杆菌中的表达、纯化活性分析
• 3.2.1 乙酰羟酸合成酶催化亚基在大肠杆菌中的表达
• 3.2.2 乙酰羟酸合成酶催化亚基蛋白的纯化
• 3.2.3 包涵体复性
• 3.2.4 乙酰羟酸合成酶活性分析
• 3.3 乙酰羟酸合成酶在毕赤酵母中的表达及粗酶液活性分析
• 3.3.1 乙酰羟酸合成酶在毕赤酵母中表达载体的构建
• 3.3.2 重组质粒的线性化
• 3.3.3 乙酰羟酸合成酶催化亚基DNA 电转化法转化毕赤酵母
• 3.3.4 AHAS 在毕赤酵母中的诱导表达
• 3.3.5 培养基中粗酶活性测定
• 3.4 乙酰羟酸合成酶农药先导化合物筛选方法的建立
• 3.4.1 通过酶活性测方法筛选农药先导化合物
• 3.4.2 荧光法筛选农药先导化合物
• 4 结果与分析
• 4.1 乙酰羟酸合成酶催化亚基 cDNA 的克隆与序列分析
• 4.1.1 总RNA 质量检测
• 4.1.2 乙酰羟酸合成酶催化亚基cDNA 的扩增
• 4.1.3 阳性克隆PCR 的鉴定
• 4.1.4 基因测序与序列提交
• 4.1.5 同源性分析
• 4.1.6 乙酰羟酸合成酶软件预测分析
• 4.2 乙酰羟酸合成酶催化亚基的原核表达
• 4.2.1 表达载体构建所需的乙酰羟酸合成酶催化亚基基因的获取
• 4.2.2 重组质粒转化JM109 后的菌落PCR 鉴定及质粒酶切鉴定
• 4.2.3 乙酰羟酸合成酶催化亚基重组蛋白的SDS-PAGE 检测
• 4.2.4 重组蛋白可溶性、纯化及复性的SDS-PAGE 检测
• 4.3 乙酰羟酸合成酶的真核表达
• 4.3.1 表达载体构建所需的乙酰羟酸合成酶催化亚基基因的获取
• 4.3.2 载体与目的基因连接方向鉴定
• 4.3.3 重组载体的酶切鉴定
• 4.3.4 重组质粒转化毕赤酵母的鉴定
• 4.3.5 9K-AHAS 基因的诱导表达
• 4.4 乙酰羟酸合成酶活性测定
• 4.4.1 标准曲线的绘制
• 4.4.2 大肠杆菌表达产物复性后酶活测定结果
• 4.4.3 酵母表达培养基上清粗酶活性测定结果
• 4.5 乙酰羟酸合成酶与两种农药及农药单嘧磺隆中间体的相互作用
• 4.5.1 三维荧光光谱
• 4.5.2 氯嘧磺隆对乙酰羟酸合成酶的荧光猝灭
• 4.5.3 氯嘧磺隆与乙酰羟酸合成酶的表观结合常数KA 以及结合位点数n
• 4.5.4 氯嘧磺隆与乙酰羟酸合成酶上结合位置的求取
• 4.6 乙酰羟酸合成酶与咪草烟的相互作用
• 4.6.1 咪草烟对乙酰羟酸合成酶的荧光猝灭
• 4.6.2 咪草烟与乙酰羟酸合成酶的表观结合常数KA以及结合位点数n
• 4.6.3 咪草烟与乙酰羟酸合成酶上结合位置的求取
• 4.7 乙酰羟酸合成酶与药物单嘧磺隆中间体的作用
• 5 讨论
• 5.1 乙酰羟酸合成酶基因催化亚基的克隆
• 5.2 乙酰羟酸合成酶基因催化亚基的原核表达与纯化
• 5.3 乙酰羟酸合成酶基因催化亚基的真核表达
• 5.4 乙酰羟酸合成酶重组蛋白活性测定
• 5.5 乙酰羟酸合成酶农药先导化合物筛选方法的建立与验证
• 6 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文