同型半胱氨酸与胰岛β细胞胰岛素分泌功能及细胞凋亡的关系及机制的研究

论文摘要

胰岛β细胞功能受损和胰岛素抵抗是2型糖尿病的两个重要发病机制,不同人群在疾病的发展不同阶段,这两种异常的侧重点有所不同,但只有β细胞功能缺陷、分泌胰岛素的质和量不足以维持正常葡萄糖代谢和难以克服胰岛素抵抗时才会出现临床高血糖。已有研究表明,β细胞功能受损与β细胞数量减少有关。一项尸检研究发现,空腹血糖受损（IFG）者和2型糖尿病患者β细胞数量均明显减少,并以后者为著;而且糖尿病患者体内β细胞凋亡频率明显增高,但增生、复制功能正常,说明β细胞凋亡增加是其数目减少的主要原因。细胞凋亡（apoptosis）是不同于细胞坏死的一种死亡形式,指细胞在生理或病理情况下发生有序的主动的非炎症死亡,又称程序性死亡。目前有关2型糖尿病β细胞凋亡机制的研究大多数集中在高糖毒性和脂毒性的作用上。长期的高血糖状态可通过氧化应激或非氧化应激途径诱导β细胞凋亡,导致胰岛素分泌减少和β细胞功能衰竭。在高糖条件下,可能通过改变Bcl基因家族中的平衡引起胰岛β细胞凋亡。氧化损伤是引起许多组织细胞凋亡的一个重要机制。与其他组织细胞相比,胰岛细胞内抗氧化物酶水平较低,因此,在一些因素的诱导下,容易发生氧化应激反应。而氧化和抗氧化作用失衡所致氧化应激引起胰岛β细胞损伤是糖尿病发生、发展的一个重要机制。国內外研究者对同型半胱氨酸致血管内皮细胞损伤和对神经细胞损伤已做了深入研究。但有关同型半胱氨酸对β细胞产生的可能影响的研究甚少。研究表明氧化应激机制在同型半胱氨酸致血管疾病、神经系统损伤中均起着重要作用。本研究通过观察不同糖耐量人群血浆同型半胱氨酸水平和胰岛细胞功能变化,探讨同型半胱氨酸对胰岛细胞功能存在的可能的影响。并进一步通过体外实验,用一种转基因来源的小鼠β细胞系NIT-1细胞,通过观察同型半胱氨酸作用下细胞生长率和胰岛素分泌的改变以及是否促使NIT-1细胞发生凋亡,来探讨同型半胱氨酸对胰岛β细胞功能存在的可能负性影响,探讨氧化应激机制在β细胞损伤中的作用,为糖尿病的治疗和胰岛功能的保护提供新的思路。本研究共分为两部分:一、不同糖耐量人群血浆同型半胱氨酸水平与胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能关系的研究目的观察不同糖耐量阶段血浆同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）水平,探讨Hcy与胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能的关系。方法选择12个月內在我院健康查体的83名符合入选标准的个体,均行标准口服75克葡萄糖耐量试验,留取空腹血标本测定血脂、肝肾功能、空腹胰岛素、空腹血糖、Hcy、CRP等指标,留取服糖后2小时血标本测定餐后2小时血糖和胰岛素水平。同时留取尿液标本测量尿微量白蛋白/肌酐水平。Hcy采用免疫荧光偏振法测定。结果所有入选个体经糖耐量试验证实有32例糖耐量正常（NGT）者,24例糖耐量减低（IGT）者和27例新诊断糖尿病（DM）者。血清CRP水平在NGT、IGT、DM各组中逐渐升高（P＜0.001）。IGT组和DM组腰围、BMI显著高于NGT组（P＜0.05,P＜0.01）.IGT组和DM组收缩压均明显高于NGT组（P＜0.01,P＜0.01）,IGT组舒张压明显高于NGT组和DM组（P＜0.01,P＜0.01）。IGT组和DM组甘油三酯水平明显高于NGT组,DM组总胆固醇水平显著高于NGT组和IGT组,NGT组和IGT组总胆固醇水平无显著差异（P＞0.05）。IGT组血肌酐水平明显高于NGT组和DM组（P＜0.05,P＜0.01）,DM组肌酐水平与NGT组之间无显著差别（P＞0.05）。IGT组和DM组空腹Hcy水平明显高于NGT组,差异具有显著性（P＜0.01,P＜0.01）,IGT组Hcy水平略高于DM组,差异无统计学意义（P＞0.05）。IGT组空腹胰岛素水平显著高于NGT组和DM组（P＜0.01,P＜0.01）,NGT组和DM组之间空腹胰岛素水平无显著差异（P＞0.05）。IGT组和DM组餐后2小时胰岛素水平显著高于NGT组（P＜0.01,P＜0.01）,DM组餐后2小时胰岛素水平显著低于IGT组,差异具有显著性（P＜0.01）。IGT组和DM组HOMA-IR湿著高于NGT组,差异具有显著性（P＜0.01,P＜0.01）,IGT组和DM组ISI显著低于NGT组,（P＜0.01,P＜0.01）,NGT组和IGT组HBCI显著高于DM组,（P＜0.01,P＜0.01）,NGT组和IGT组HBCI无显著差异（P＞0.05）,经HOMA-IR校正之后,NGT组HBCI/IR显著高于IGT组,（P＜0.01）。IGT组FBCI显著高于NGT组和DM组（P＜0.05,P＜0.01）,经HOMA-IR校正之后,NGT组FBCI/IR显著高于IGT组和DM组（P＜0.05,P＜0.01）,IGT组FBCI显著高于DM组（P＜0.01）。NGT组的△I120/△G120、△I120/△G120/IR显著高于IGT组和DM组,差异具有显著性（P＜0.01,P＜0.01）,IGT组△I120/△G120、△I120/△G120/IR显著高于DM组,差异具有显著性（P＜0.01）。Spearman相关分析显示Hcy与HOMA-IR（r=0.335,P=0.030）,与ISI（r=-0.335,P=0.030）呈显著负相关,与HBCI（r=-0.260,P=0.096）、FBCI（r=-0.039,P=0.808）和△I120/△G120（r=-0.253,P=0.107）呈负相关,但未达统计学意义,经HOMA-IR校正后,Hcy与HBCI/IR（r=-0.369,P=0.016）、FBCI/IR（r=-0.415,P=0.006）和△I120/△G120/IR（r=-0.335,P=0.030）呈显著负相关性。多元逐步回归分析显示,腰围、尿Alb/Cr、FINS、HOMA-IR、FBCI和FBCI/IR对Hcy有显著影响。结论糖耐量异常患者较糖耐量正常人相比往往合并更多的代谢异常,代谢综合征的发生率高。糖耐量异常患者胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能受损程度明显,且糖耐量受损者其血浆Hcy水平高于糖耐量正常者。胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损与糖耐量异常者血浆Hcy水平明显相关。二、同型半胱氨酸对胰岛β细胞胰岛素分泌及凋亡的影响及机制的研究目的观察同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）对克隆的胰岛β细胞NIT-1细胞株胰岛素分泌、细胞生存率及细胞凋亡的影响,以及对细胞内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）的影响。方法将Hcy作用于NIT-1细胞后,用放射免疫分析法检测不同浓度Hcy作用不同时间后对细胞胰岛素分泌的影响;用溴化（4,5二甲2噻唑基）2,5二苯基四氮唑分析法检测细胞生存率;流式细胞仪Annexin V/PI双染色法和琼脂糖凝胶电泳检测不同浓度的Hcy作用不同时间对NIT-1细胞凋亡的影响;用黄嘌呤氧化酶法和WST结合的方法检测Hcy作用后的NIT-1细胞內SOD的活性。Western blot免疫印记法测定Bax和Bcl-2蛋白表达。结果50μmol/L的Hcy作用24h以及100μmol/L的Hcy作用12h后,细胞胰岛素的分泌量较正常对照组相比分别下降了17.1%和10.8%,差异具有统计学意义（P＜0.01;P＜0.01）。100μmol/L的Hcy作用12h、24h后细胞存活率分别降至94.56%、87.93%,与对照组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）;50μmol/L的Hcy作用48h、72h后,细胞存活率分别降至91.26%、87.21%,与对照组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）。当100μmol/L Hcy作用24h,NIT-1细胞凋亡率为7.21%（P＜0.01）;250μmol/L的Hcy作用12h,NIT-1细胞凋亡率为12.93%（P＜0.05）。琼脂糖凝胶电泳显示随着Hcy浓度增加,凋亡NIT-1细胞的DNA电泳条带呈现为明显的梯形条带。100μmol/L的Hcy作用24小时后NIT-1细胞內SOD活性较正常组细胞下降20.2%（P＜0.01）。随着Hcy浓度的增加,Bax的蛋白表达逐渐增加（P＜0.05）。结论Hcy对NIT-1细胞胰岛素分泌的抑制作用呈时间、剂量依赖性。Hcy对细胞的生存率具有抑制作用,且可以用时间和浓度依赖性的方式诱导NIT-1细胞凋亡。这些有害作用可能是通过抑制细胞内的SOD的活性而发挥作用,为研究保护胰岛细胞功能提供一种新的思路。结论1.糖耐量异常患者胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能受损程度明显,且糖耐量受损者其血浆Hcy水平高于糖耐量正常者。胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损与糖耐量异常者血浆Hcy水平明显相关。2.同型半胱氨酸以时间、剂量依赖性的方式抑制NIT-1细胞的胰岛素分泌,并诱导NIT-1细胞凋亡,使促凋亡蛋白Bax的蛋白表达增加。Hcy可以抑制NIT-1细胞的生存率,降低细胞内SOD的活性,β细胞抗氧化能力的降低。

论文目录

• 英文缩写表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 不同糖耐量人群血浆同型半胱氨酸水平与胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能关系的研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 对象和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 同型半胱氨酸对胰岛β细胞胰岛素分泌及凋亡的影响及机制的研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 博士期间发表与撰写文章
• 致谢